使用雜交鏈式反應的基因表達的高度多重檢測的制作方法

            文檔序號:39656127發布日期:2024-10-15 12:58閱讀:4897來源:國知局
            使用雜交鏈式反應的基因表達的高度多重檢測的制作方法

            本發明涉及用于樣品中核苷酸的高度多重快速檢測的方法,以及用于所述方法中的構建體。


            背景技術:

            1、微生物群通常與彼此及其環境形成復雜的群落,其可以包括真核細胞。這些微生物的空間定位可以對生態系統產生影響,盡管描述每種細菌的功能是一個挑戰。


            技術實現思路

            0、發明概述

            1、空間轉錄組學是在其天然生物學背景下鑒定細胞中特定mrna分子的方法,可以是強大的工具,但迄今為止主要是為真核系統開發的,沒有觸及分析微生物群落的空間特性的方法。為了準確和全面地分析微生物組轉錄組,可能需要具有高靶標多重性,能夠潛在地標記數百萬個基因靶標的方法。這種方法的開發可能會徹底改變我們對微生物群落組裝的理解,并導致新的診斷和治療應用。

            2、在一個方面,提供了用于分析樣品的方法,該方法可以包括使至少一個編碼探針與樣品接觸以產生第一復合物,向第一復合物添加至少兩個不同的dna擴增子以產生第二復合物,以及向第二復合物添加發射讀出探針。每個編碼探針可以包括靶向序列和起始子序列。每個dna擴增子可以包括起始子互補序列和讀出序列。每個發射讀出探針可以包括標記和相應的dna擴增子的讀出序列的互補序列。

            3、在另一方面,用于分析樣品的方法可以包括生成一組探針,其中每個探針包括:

            4、(i)靶向序列;

            5、(ii)至少一個起始子序列;和

            6、(iii)至少兩個dna擴增子,其中每個dna擴增子包括起始子互補序列和讀出序列;

            7、使該組探針與樣品接觸以允許探針與樣品中存在的核苷酸雜交以產生復合物;

            8、向復合物添加一組發射讀出探針,其中每個發射讀出探針包括標記和相應的dna擴增子的讀出序列的互補序列;

            9、檢測樣品中的發射讀出探針;

            10、確定“信號”(如例如,點、斑點)的光譜并將它們分配至細菌;和

            11、通過信號去卷積、錯誤校正、與參考標準比較的方法將所述光譜解碼成單個靶向轉錄物。

            12、在另一方面,用于分析細胞的方法可以包括:

            13、使至少一個編碼探針與細胞接觸以產生第一復合物,其中每個編碼探針包括mrna靶向序列和起始子序列;

            14、將兩個不同的dna擴增子添加至第一復合物以產生第二復合物,其中每個dna擴增子包括起始子互補序列和讀出序列;和

            15、向第二復合物添加兩個發射讀出探針,其中每個發射讀出探針包括熒光團和相應的dna擴增子的讀出序列的互補序列。

            16、在另一方面,構建體可以包含與dna/rna序列上感興趣的區域互補的靶向序列、第一起始子序列、不同于第一起始子序列的第二起始子序列、在序列的5’末端包含讀出序列的第一擴增子序列、在序列的3’末端包含讀出序列的第二擴增子序列,其中第二擴增子序列不同于第一擴增子序列,以及包含與第一和/或第二擴增子序列的讀出序列互補的序列和在互補序列的5’和/或3’末端的標記的發射讀出序列。

            17、在另一方面,構建體可以包含靶向序列(其是核苷酸上的感興趣的區域)、第一起始子序列、不同于第一起始子序列的第二起始子序列、包含第三起始子序列的第一擴增子序列、包含第四起始子序列的第二擴增子序列、在序列的5’末端包含讀出序列的第三擴增子序列、在序列的3’末端包含讀出序列的第四擴增子序列,其中第一、第二、第三和第四擴增子序列彼此不同,以及包含與第三和/或第四擴增子序列的讀出序列互補的序列和在互補序列的5’和/或3’末端的標記的發射讀出序列。

            18、在另一方面,構建體的文庫可以包括多個條形碼化探針,其中每個條形碼化探針可以包括:

            19、靶向序列,其為核苷酸上感興趣的區域;

            20、至少一個起始子序列;和

            21、兩個dna擴增子,其中每個dna擴增子包括讀出序列;和

            22、發射讀出探針,其中每個發射讀出探針包括標記和與相應的dna擴增子的讀出序列互補的序列;

            23、其中多個條形碼化探針中的至少兩個條形碼化探針包括對不同的感興趣的區域具有特異性的靶向序列。

            24、在另一方面,構建體的文庫可以包括多個條形碼化探針,其中每個條形碼化探針可以包括:

            25、靶向序列,其為核苷酸上感興趣的區域;

            26、第一起始子序列;

            27、第一dna擴增子和第二dna擴增子,其中每個第一dna擴增子和第二dna擴增子包括第二起始子序列;

            28、第三dna擴增子和第四dna擴增子,其中每個第三dna擴增子和第四dna擴增子包括讀出序列;和

            29、發射讀出探針,其中每個發射讀出探針包括標記和與相應的第三和/或第四dna擴增子的讀出序列互補的序列;

            30、其中多個條形碼化探針中的至少兩個條形碼化探針包括對不同的感興趣的區域具有特異性的靶向序列。

            31、在另一方面,用于分析樣品的方法可以包括:

            32、使至少一個編碼探針與樣品接觸以產生第一復合物,其中每個編碼探針可以包括靶向序列和起始子序列;

            33、將至少兩個不同的dna擴增子添加至第一復合物以產生第二復合物,其中每個dna擴增子可以包括起始子互補序列和讀出(著陸墊)序列;

            34、向第二復合物添加一組第一發射讀出探針,其中每個第一發射讀出探針可以包括標記和相應的dna擴增子的讀出(著陸墊)序列的互補序列;

            35、從該組第一發射讀出探針獲取一個或多個發射光譜;

            36、向樣品添加hipr-swap第一交換探針組,其中每個第一交換探針包括與第一發射讀出探針序列100%互補的序列,

            37、使第一交換探針與第一發射讀出探針雜交以形成第三復合物;

            38、從樣品中除去第三復合物,

            39、向第二復合物添加一組第二發射讀出探針,其中每個第二發射讀出探針可以包括標記和相應的dna擴增子的讀出(著陸墊)序列的互補序列;

            40、從第二發射讀出探針獲取一個或多個發射光譜;

            41、對至少一個不同的編碼探針重復上述步驟。

            42、本文公開的其他方面、實施方案和特征將從以下描述、附圖和權利要求中顯而易見。



            技術特征:

            1.用于分析樣品的方法,所述方法包括:

            2.用于分析樣品的方法,所述方法包括:

            3.權利要求1或2所述的方法,其中所述樣品是以下至少一種:細胞、細胞懸浮液、組織活檢、組織標本、尿液、糞便、血液、血清、血漿、骨活檢、骨髓、呼吸道標本、痰、誘導痰、氣管抽吸物、支氣管肺泡灌洗液、汗液、唾液、眼淚、眼液、腦脊液、心包液、胸膜液、腹膜液、胎盤、羊膜、膿、鼻拭子、鼻咽拭子、口咽拭子、眼拭子、皮膚拭子、傷口拭子、粘膜拭子、頰拭子、陰道拭子、外陰拭子、指甲、指甲刮片、毛囊、角膜刮片、灌胃液、漱口液、膿腫液、廢水或植物活檢。

            4.權利要求3所述的方法,其中所述樣品是細胞。

            5.權利要求4所述的方法,其中所述細胞是細菌或真核細胞。

            6.權利要求3所述的方法,其中所述樣品包含多個細胞。

            7.權利要求4所述的方法,其中每個細胞包含特異性靶向序列。

            8.權利要求1或2所述的方法,其中所述靶向序列靶向以下至少一種:信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、長非編碼rna(lncrna)、核糖體rna(rrna)、小干擾rna(sirna)、轉運rna(trna)、crispr?rna(crrna)、反式激活crispr?rna(tracrrna)、線粒體rna、內含子rna、病毒mrna、病毒基因組rna、環境rna、雙鏈rna(dsrna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、piwi相互作用rna(pirna)、基因組dna、合成dna、dna、質粒dna、質粒、病毒dna、逆轉錄病毒dna、環境dna、細胞外dna、蛋白質、小分子或抗原性靶標。

            9.權利要求8所述的方法,其中所述靶標是mrna。

            10.權利要求8所述的方法,其中所述靶標是rrna。

            11.權利要求8所述的方法,其中所述靶標是mrna和rrna。

            12.權利要求1或2所述的方法,其中所述編碼探針在5’末端和/或3’末端包含所述起始子序列。

            13.權利要求12所述的方法,其中所述編碼探針在5’末端包含起始子序列,并且在3’末端包含起始子序列。

            14.權利要求13所述的方法,其中所述兩個起始子序列具有不同的序列。

            15.權利要求13所述的方法,其中所述兩個起始子序列具有相同的序列。

            16.權利要求1或2所述的方法,其中所述編碼探針包含兩個部分起始子序列。

            17.權利要求1或2所述的方法,其中所述兩個dna擴增子之一從5’至3’包含讀出序列(r.1)、立足點序列(t.1)、莖序列(s.1)、環序列(l.1)和互補莖序列(cs.1)。

            18.權利要求1或2所述的方法,其中所述兩個dna擴增子之一從5’至3’包含莖序列(s.2)、環序列(l.2)、互補莖序列(cs.2)、立足點序列(t.2)和讀出序列(r.2)。

            19.權利要求17或18所述的方法,其中所述兩個dna擴增子進一步包含間隔區序列,其中所述間隔區序列為約1至3個核苷酸長。

            20.權利要求17至19中任一項所述的方法,其中所述立足點序列(t.1)是與另一dna擴增子的所述環序列(l.2)互補的序列。

            21.權利要求17至20中任一項所述的方法,其中所述環序列(l.1)是與另一dna擴增子的所述立足點序列(t.2)互補的序列。

            22.權利要求17至21中任一項所述的方法,其中每個dna擴增子的所述讀出序列是相同的序列。

            23.權利要求17-21中任一項所述的方法,其中每個dna擴增子的所述讀出序列是不同的。

            24.權利要求1或2所述的方法,其中所述方法包括添加四個dna擴增子。

            25.權利要求24所述的方法,其中所述四個dna擴增子之一從5’至3’包含擴增子起始子序列(hi.1)、立足點序列(t.1)、莖序列(s.1)、環序列(l.1)和互補莖序列(cs.1)。

            26.權利要求24所述的方法,其中所述四個dna擴增子之一從5’至3’包含莖序列(s.2)、環序列(l.2)、互補莖序列(cs.2)、立足點序列(t.2)和擴增子起始子序列(hi.2)。

            27.權利要求24所述的方法,其中所述四個dna擴增子之一從5’至3’包含讀出序列(r.1-2)、立足點序列(t.1-2)、莖序列(s.1-2)、環序列(l.1-2)和互補莖序列(cs.1-2)。

            28.權利要求24所述的方法,其中所述四個dna擴增子之一從5’至3’包含莖序列(s.2-1)、環序列(l.2-1)、互補莖序列(cs.2-1)、立足點序列(t.2-1)和讀出序列(r.2-1)。

            29.權利要求24-28中任一項所述的方法,其中所述四個dna擴增子進一步包含間隔區序列,其中所述間隔區序列為約1至3個核苷酸長。

            30.權利要求25-29中任一項所述的方法,其中所述擴增子起始子序列(hi.1)是與包含所述讀出序列的另一dna擴增子之一的所述環序列(l.1-2或l.2-1)互補的序列。

            31.權利要求25-30中任一項所述的方法,其中所述立足點序列(t.1)是與包含所述擴增子起始子序列的另一dna擴增子的所述環序列(l.2)互補的序列。

            32.權利要求25-31中任一項所述的方法,其中所述環序列(l.1)是與包含所述擴增子起始子序列的另一dna擴增子的所述立足點序列(t.2)互補的序列。

            33.權利要求1或2所述的方法,其中所述發射讀出探針在5’末端或3’末端包含標記。

            34.權利要求1或2所述的方法,其中所述發射讀出探針在5’末端包含標記,并且在3’末端包含標記。

            35.權利要求34所述的方法,其中所述標記是相同的。

            36.權利要求34所述的方法,其中所述標記是不同的。

            37.權利要求33-36中任一項所述的方法,其中所述標記是:alexa?fluor350、alexafluor?405、alexa?fluor?430、alexa?fluor?488、alexa?fluor?514、alexa?fluor?532、alexa?fluor?546、alexa?fluor?555、alexa?fluor?561、alexa?fluor?568、alexa?fluor594、alexa?fluor?610、alexa?fluor?633、alexa?fluor635、alexa?fluor?647、alexafluor?647-r-藻紅蛋白、alexa?fluor?660、alexa?fluor?680、alexa?fluor?680-別藻藍蛋白、alexa?fluor?700、alexa?fluor?750、alexa?fluor?790、alexa?fluor?plus?405、alexafluor?plus?488、alexa?fluor?plus555、alexa?fluor?plus?594、alexa?fluor?plus?647、alexa?fluor?plus?680、alexa?fluor?plus?750、alexa?fluor?plus?800、太平洋藍、太平洋綠、羅丹明紅x、dylight?485-ls、dylight-510-ls、dylight?515-ls、dylight?521-ls、羥基香豆素、甲氧基香豆素、cy2、fam、熒光素fitc、r-藻紅蛋白(pe)、tamara、cy3.5?581、rox、紅613、德克薩斯紅、cy5、cy5.5、cy7、別藻藍蛋白、atto?430ls、atto?490ls、atto?390、atto425、青色500nhs-酯、atto?465、atto?488、atto?495、atto?rho110、atto?514、atto?520、atto?532、atto?rho6g、atto?542、atto?550、atto?565、atto?rho3b、atto?rho11、attorho12、atto?thio12、atto?rho101、atto?590、atto?594、atto?rho13、atto?610、atto?620、atto?rho14、atto?633、atto?643、atto?647、atto?647n、atto?655、atto?oxa12、atto?665、atto?680、atto?700、atto?725、atto?740。

            38.權利要求1或2所述的方法,其中所述標記使用寬場顯微鏡、點掃描共焦顯微鏡、旋轉盤共焦顯微鏡、晶格光片顯微鏡或光場顯微鏡進行成像。

            39.權利要求38所述的方法,其中所使用的檢測策略是通道、光譜、通道和熒光壽命、或光譜和熒光壽命。

            40.權利要求1或2所述的方法,其中所述樣品在分析平臺上,其中所述分析平臺是顯微鏡載玻片、至少一個腔室、至少一個微流體裝置、至少一個孔、至少一個板或至少一個過濾膜。

            41.用于分析細胞的方法,所述方法包括:

            42.構建體,其包含:

            43.權利要求42所述的構建體,其中所述核苷酸上感興趣的區域是以下至少一個:信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、長非編碼rna(lncrna)、核糖體rna(rrna)、小干擾rna(sirna)、轉運rna(trna)、crispr?rna(crrna)、反式激活crispr?rna(tracrrna)、線粒體rna、內含子rna、病毒mrna、病毒基因組rna、環境rna、雙鏈rna(dsrna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、piwi相互作用rna(pirna)、基因組dna、合成dna、dna、質粒dna、質粒、病毒dna、逆轉錄病毒dna、環境dna、細胞外dna、蛋白質、小分子或抗原。

            44.權利要求43所述的構建體,其中所述核苷酸上感興趣的區域是mrna。

            45.權利要求43所述的構建體,其中所述核苷酸上感興趣的區域是rrna。

            46.權利要求43所述的構建體,其中所述核苷酸上感興趣的區域是mrna和rrna。

            47.權利要求42所述的構建體,其中所述第一起始子序列位于所述靶向序列的5’末端。

            48.權利要求42所述的構建體,其中所述第二起始子序列位于所述靶向序列的3’末端。

            49.權利要求42-48中任一項所述構建體,其中所述第一擴增子從5’至3’包含讀出序列(r.1)、立足點序列(t.1)、莖序列(s.1)、環序列(l.1)和互補莖序列(cs.1)。

            50.權利要求42-49中任一項所述的構建體,其中所述第二擴增子從5’至3’包含莖序列(s.2)、環序列(l.2)、互補莖序列(cs.2)、立足點序列(t.2)和讀出序列(r.2)。

            51.權利要求42-50中任一項所述的構建體,其中所述每個擴增子進一步包含間隔區序列,其中所述間隔區序列為約1至3個核苷酸長。

            52.權利要求49-51中任一項所述的構建體,其中所述第一擴增子的所述立足點序列(t.1)是與所述第二擴增子的所述環序列(l.2)互補的序列。

            53.權利要求49-51中任一項所述的構建體,其中所述第一擴增子的所述環序列(l.1)是與所述第二擴增子的所述立足點序列(t.2)互補的序列。

            54.權利要求42-53中任一項所述的構建體,其中所述第一擴增子和所述第二擴增子具有相同的讀出序列。

            55.權利要求42-53中任一項所述的構建體,其中所述第一擴增子和所述第二擴增子具有不同的讀出序列。

            56.權利要求42-55中任一項所述的構建體,其中所述發射讀出序列包含與所述第一擴增子序列的所述讀出序列互補的序列。

            57.權利要求42-56中任一項所述的構建體,其中所述發射讀出序列包含與所述第二擴增子序列的所述讀出序列互補的序列。

            58.權利要求42-57中任一項所述的構建體,其中所述發射讀出序列包含在所述互補序列的5’末端的標記。

            59.權利要求42-58中任一項所述的構建體,其中所述發射讀出序列包含在所述互補序列的3’末端的標記。

            60.權利要求42-59中任一項所述的構建體,其中所述發射讀出序列包含在所述互補序列的5’末端和3’末端的標記。

            61.權利要求42-60中任一項所述的構建體,其中所述標記是:alexa?fluor350、alexafluor?405、alexa?fluor?430、alexa?fluor?488、alexa?fluor?514、alexa?fluor?532、alexa?fluor?546、alexa?fluor?555、alexa?fluor?561、alexa?fluor?568、alexa?fluor594、alexa?fluor?610、alexa?fluor?633、alexa?fluor635、alexa?fluor?647、alexafluor?647-r-藻紅蛋白、alexa?fluor?660、alexa?fluor?680、alexa?fluor?680-別藻藍蛋白、alexa?fluor?700、alexa?fluor?750、alexa?fluor?790、alexa?fluor?plus?405、alexafluor?plus?488、alexa?fluor?plus555、alexa?fluor?plus?594、alexa?fluor?plus?647、alexa?fluor?plus?680、alexa?fluor?plus?750、alexa?fluor?plus?800、太平洋藍、太平洋綠、羅丹明紅x、dylight?485-ls、dylight-510-ls、dylight?515-ls、dylight?521-ls、羥基香豆素、甲氧基香豆素、cy2、fam、熒光素fitc、r-藻紅蛋白(pe)、tamara、cy3.5?581、rox、紅613、德克薩斯紅、cy5、cy5.5、cy7、別藻藍蛋白、atto?430ls、atto?490ls、atto?390、atto425、青色500nhs-酯、atto?465、atto?488、atto?495、atto?rho110、atto?514、atto?520、atto?532、atto?rho6g、atto?542、atto?550、atto?565、atto?rho3b、atto?rho11、attorho12、atto?thio12、atto?rho101、atto?590、atto?594、atto?rho13、atto?610、atto?620、atto?rho14、atto?633、atto?643、atto?647、atto?647n、atto?655、atto?oxa12、atto?665、atto?680、atto?700、atto?725、atto?740。

            62.構建體,其包含:

            63.構建體文庫,其包含多個條形碼化探針,其中每個條形碼化探針包含:

            64.構建體文庫,其包含多個條形碼化探針,其中每個條形碼化探針包含:


            技術總結
            本文描述了用于樣品中核苷酸的快速、高度多重檢測的方法和制備用于所述方法中的構建體。

            技術研發人員:P·S·伯恩漢姆,G·T·布瑟,H·布羅森,M·P·程,I·德弗拉敏克,H·石,P·塞加爾
            受保護的技術使用者:坎瓦斯生物科學股份有限公司
            技術研發日:
            技術公布日:2024/10/14
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