一種檢測miRNA-223的體系及其在制備診斷慢性阻塞性肺疾病試劑盒中的應用的制作方法

本發明涉及生物，特別是涉及一種檢測mirna-223的體系及其在制備診斷慢性阻塞性肺疾病試劑盒中的應用。

背景技術：

1、慢性阻塞性肺疾病(chronic?obstructive?pulmonary?disease，copd，慢性肺阻病)是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和/或肺氣腫，可進一步發展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病。與有害氣體及有害顆粒的異常炎癥反應有關，致殘率和病死率很高，全球40歲以上發病率已高達9％-10％。

2、copd的確切病因不清楚，一般認為與慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫發生有關的因素都可能參與慢性阻塞性肺病的發病。目前copd診斷的方式主要為肺功能篩查(阻塞性通氣功能障礙)、肺部ct(診斷依據為肺泡膨脹以及局限性/彌散性肺大皰、肺氣腫)，以及對常見臨床表現的觀察(如桶狀胸、肺呼吸音減低以及出現心功能不全時可能伴隨有下肢浮腫及心律失常等)。因此，會存在如下問題：1、檢測流程較復雜(患者可能需要進行多項檢測才能獲得診斷)；2、診斷結果對醫生水平依賴度極高；3、費用較高(約6366元)；4、所用時間較長，效率較低；5、存在一定幾率的誤診現象，誤診率62％左右，且已診斷患者在實際患者數量中占比小(未確診人數占總患者人數95％左右)。因此，尋找一種檢測流程簡單、有效確診、誤診率低且對醫生水平依賴性較低的方式對copd的診斷有重要意義。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供一種檢測mirna-223的體系及其在制備診斷慢性阻塞性肺疾病試劑盒中的應用，以解決上述現有技術存在的問題。本發明提供的體系檢測流程簡單，能夠有效確診copd，且具有誤診率低以及對醫生水平依賴性較低的優勢。

2、為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

3、本發明提供了一種檢測mirna-223的體系所述檢測體系包括鎖式探針、cas12a蛋白、crrna和熒光表達分子；

4、所述鎖式探針的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

5、所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

6、所述熒光表達分子的序列為5’-fam-ttatt-iabkfq-3’。

7、優選的，所述體系還包括反應緩沖液、splintr連接酶、phi29聚合酶、牛血清蛋白和dntps。

8、本發明提供了上述的體系在制備診斷慢性阻塞性肺疾病的試劑盒中的應用。

9、優選的，所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：

10、(1)將所述待測樣品中的mirna-223、鎖式探針和反應緩沖溶液混合后，變性，得到變性產物；

11、(2)配制crispr/cas12a反應液，所述crispr/cas12a反應液包括所述的crrna、cas12a蛋白、熒光表達分子和所述變性產物；

12、(3)利用步驟(2)制備的crispr/cas12a反應液進行crispr/cas12a反應后，檢測熒光強度。

13、優選的，所述待測樣品包括血液，即被測試者的血液樣本。

14、本發明提供了一種用于診斷慢性阻塞性肺疾病的試劑盒，所述試劑盒包括上述的體系。

15、優選的，所述試劑盒的檢測樣本包括血液，即被測試者的血液樣本。

16、本發明提供了一種非診斷目的的mirna-223檢測方法，包括以下步驟：

17、(1)將所述待測樣品中的mirna-223、鎖式探針和反應緩沖溶液混合后，變性，得到變性產物；

18、(2)配制crispr/cas12a反應液，所述crispr/cas12a反應液包括所述的crrna、cas12a蛋白、熒光表達分子和所述變性產物；所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述熒光表達分子的序列為5’-fam-ttatt-iabkfq-3’；

19、(3)利用步驟(2)制備的crispr/cas12a反應液進行crispr/cas12a反應后，檢測熒光強度。

20、優選的，所述待測樣品包括血液，即被測試者的血液樣本。

21、本發明公開了以下技術效果：

22、本發明提供的體系以及試劑盒檢測流程簡單，反應時間短，僅需要2h，能夠有效確診copd，具有誤診率低以及對醫生水平依賴性較低的優勢；而且檢測費用低，每次檢測平均試劑花費4.2元，大幅度減少了費用。同時該體系和試劑盒的檢測精度為20fm，mirna-223識別度高，即mirna-223單堿基變化可識別。與市售的試劑盒相比，具有明顯的優勢。

技術特征：

1.一種檢測mirna-223的體系，其特征在于，所述檢測體系包括鎖式探針、cas12a蛋白、crrna和熒光表達分子；

2.根據權利要求1所述的體系，其特征在于，所述體系還包括反應緩沖液、splintr連接酶、phi29聚合酶、牛血清蛋白和dntp。

3.權利要求1或2所述的體系在制備診斷慢性阻塞性肺疾病的試劑盒中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述待測樣品包括血液。

6.一種用于診斷慢性阻塞性肺疾病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1或2所述的體系。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測樣本包括血液。

8.一種非診斷目的的mirna-223檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.根據權利要求8所述的mirna-223檢測方法，其特征在于，所述待測樣品包括血液。

技術總結
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種檢測miRNA?223的體系及其在制備診斷慢性阻塞性肺疾病試劑盒中的應用。本發明提供的體系以及試劑盒檢測流程簡單，反應時間短，僅需要2h，能夠有效確診慢性阻塞性肺疾病，具有誤診率低以及對醫生水平依賴性較低的優勢；而且檢測費用低，每次檢測平均試劑花費4.2元。同時該體系和試劑盒的檢測精度為20fM，miRNA?223識別度高，即miRNA?223單堿基變化可識別。與市售的試劑盒相比，具有明顯的優勢。

技術研發人員：馬鑫峣,程銘,董一名
受保護的技術使用者：蘇州硅基生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/10/14