基于細胞的用于測定肉毒桿菌毒素活性的方法與流程

【】本發明涉及用于確定肉毒桿菌毒素活性的細胞和抗體，以及使用它們確定活性的方法。

背景技術

0、
背景技術：

1、目前，小鼠ld50生物測定(mld50)是一種普遍接受的用于檢測食品，臨床或環境樣品中殘余肉毒桿菌毒素(bont/a)的方法。特別地，制藥行業使用mld50作為標準分析方法來測量用于美容或臨床應用的肉毒桿菌毒素滴度。然而，由于使用mld50的肉毒毒素滴度測定受到測試機構/設施和研究人員的高度影響，因此難以準確、可重復地定量肉毒毒素的生物學功效。因此，為了最大程度地減少實驗中使用的動物的數量和痛苦并標準化測量肉毒毒素滴度的方法，舉行了zebet會議以鼓勵開發替代性的mld50測量方法(altern?labanim.2010aug；38(4):315-30)。在各個國家，許多研究機構和行業進行了各種研究，以開發基于細胞的滴度測定(cbpa)或基于細胞的生物測定(cbb)，就特異性、敏感性和可重復性而言，它們足以替代mld50。為了成功建立cbpa或cbb，他們一直試圖獲取(1)對snap25197特異的單克隆或多克隆抗體，和(2)對低水平的肉毒桿菌毒素(～pm)表現出高敏感性的神經元細胞系。早在2004年，chapman博士和他的同事發明了一種將肉毒桿菌毒素與兩種熒光蛋白融合的熒光報告基因測定方法(proc?natl?acad?sci?usa.2004?oct?12；101(41):14701-6)，其以bocelltm分析方法(biosentinel?inc)的名稱命名并商業化。盡管bocelltm測定法作為第一個能夠檢測在98孔培養皿中培養的動物細胞的肉毒桿菌毒素的中性內肽酶活性的測定法具有重要意義，但它存在一個問題，其靈敏度卻比使用小鼠的測定法低2-3倍(appl?environ?microbiol?vol.78,21(2012)：7687-97)。如上所述，在全球范圍內一直努力開發cbpa以替代mld50，因此最終有望終止使用動物的分析方法。盡管開發有效的cpba仍有待解決的挑戰，但開發有效的cbpa將有助于擴大各種肉毒桿菌毒素產品的用途，提高質量控制水平，為消費者提供更高水平的信心，增強肉毒桿菌毒素產品的競爭力。

2、因此，本發明旨在克服常規cpba的局限性并開發更有效的cbpa。通過本發明的cpba，對13種不同的神經元細胞系進行了比較分析，并開發了在構成神經元細胞的廣泛克隆中最優化的新克隆n2-42f。該克隆的分裂時間很短，小于24小時，與sima相比，由于它可以附著在涂有聚-d-賴氨酸(pdl)的培養皿中并在其中穩定培養，因此預計作為cbpa的細胞非常有用。

3、本發明還涉及一種用于cpba的抗體，用于替代小鼠ld50生物測定(mld50)。本發明中的抗體是一種對snap25具有顯著高結合親和力和特異性的單克隆抗體。本發明的抗體克服了常規cpba的局限性，使得開發更有效的cbpa成為可能，因此有望在醫藥和化妝品領域得到積極應用。

4、此外，本發明涉及使用n2-42f細胞和對snap25具有顯著高的結合親和力和特異性的單克隆抗體的最佳cbpa測定法，并且其可以測量0.5u或以下的肉毒桿菌毒素的滴度。使用本發明的細胞和抗體的cbpa測定有望成為具有高可靠性和再現性的肉毒毒素滴度的基于細胞的測定。

5、【公開】

6、【技術問題】

7、本發明涉及用于確定肉毒桿菌毒素活性的細胞和抗體，以及使用它們確定活性的方法。

8、然而，本發明所要實現的技術目的不限于上述技術目的，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解上述未提及的其他目的。

9、【技術方案】

10、在下文中，將參考附圖描述本文描述的各種實施方式。在以下描述中，闡述了許多具體細節，例如特定的配置，組合物和過程等，以便提供對本發明的透徹理解。然而，可以在沒有這些特定細節中的一種或多種的情況下實踐某些實施方案，或者與其他已知方法和配置組合。在其他情況下，已知的方法和制備技術尚未詳細描述，避免不必要地模糊本發明。在本發明中“一個實施方式”或“一個實施方式”的引用是指與實施例關聯描述的特定性能、結構、組合或特征包括在本發明的至少一個實施方式中。因此，在整個說明書中的各個地方出現的短語“在一個實施方式中”或“一個實施方式”不一定指本發明的同一實施方式。另外，可以在一個或多個實施方式中以任何合適的方式組合特定性能、結構、組合或特征。

11、除說明書中另有規定外，說明書中使用的科學技術術語均與本發明所在技術領域的技術人員的一般理解相同。

12、的制造商allergan公司已成功構建一種對snap25197有特異性的單克隆抗體，并將人神經母細胞瘤細胞系(sima)鑒定為對肉毒桿菌毒素高度敏感的理想宿主細胞系(plos?one.2012；7(11):e49516)。使用這些抗體和細胞，allergan開發了一種新型cbpa測定方法，并于2010年作為第一個能夠替代mld50的cbpa獲得fda批準(us8455213b2和us2010/0204559a1)。德國的merz，另一個肉毒桿菌毒素制造商，2014年開發了cba-elisa(wo?2014/207109a1)并于2015年獲得fda批準。cba-elisa采用分化的神經元細胞的固定方法(原位)，然后通過細胞膜滲透，進行內源性snap25(突觸體神經相關蛋白25)的免疫學檢測。allergan的cbpa和merz的cba-elisa在亞皮摩爾濃度(即<1.0u/孔)的ec50下顯示出與小鼠生物測定相同水平的優異的靈敏度。。allergan和merz的技術利用常用的商業兔多克隆抗體(sigma?s9684)在最佳條件下檢測snap25。就細胞而言,在allergan的cbpa專門使用分化的人神經母細胞瘤細胞系sima，而merz的cba-elisa使用人分化的誘導多能干細胞(ips)作為標準化和優化的宿主細胞。sima增值非常緩慢，通常細胞數量翻倍所需的時間(群體倍增時間，pdt)超過70小時。ips的產生非常耗時，并且儲存也更加困難。因此，需要開發對肉毒桿菌毒素非常敏感，pdt短且易于保存的cbpa神經元細胞系。此外，由威斯康星大學的david?beebe博士領導的研究小組提出了一個關于sima作為cbpa細胞適用性的問題，因為sima未表現出運動神經元樣的特征(j?biomol?screen.2016jan；21(1):65-73)。他們用運動神經元樣細胞系ng108-15開發了另一種替代的cbpa，即使在ec50濃度為7.9pm或更低時也顯示出敏感性。然而，由于開發的cbpa使用western印跡來確定snap25197和snap25fl的內源性水平，在高通量分析中很難使用它們。

13、本發明提供以下實施方案：

14、1.一種特異性結合snap25的抗體，其中所述snap25是snap25fl或snap25197，其包含：

15、(a)seq?id?no:12所示的重鏈cdr1區域；seq?id?no:15所示的重鏈cdr2區域；seqid?no:18所示的重鏈cdr3區域；

16、seq?id?no:21所示的輕鏈cdr1區域；seq?id?no:24所示的輕鏈cdr2區域；以及seqid?no:26所示的輕鏈cdr3區域；或

17、(b)seq?id?no:13所示的重鏈cdr1區域；seq?id?no:16所示的重鏈cdr2區域；seqid?no:19所示的重鏈cdr3區域；

18、seq?id?no:22所示的輕鏈cdr1區域；seq?id?no:24所示的輕鏈cdr2區域；以及seqid?no:27所示的輕鏈cdr3區域；或

19、(c)seq?id?no:56所示的重鏈cdr1區域；seq?id?no:58所示的重鏈cdr2區域；seqid?no:60所示的重鏈cdr3區域；

20、seq?id?no:62所示的輕鏈cdr1區域；seq?id?no:64所示的輕鏈cdr2區域；以及seqid?no:66所示的輕鏈cdr3區域。

21、2.一種抗體組合物，其包含實施方案1所述的抗體。

22、3.一種固相載體，其包含實施方案1所述的抗體，其中所述抗體固定在所述固相載體的表面。

23、4.一種試劑盒，其包含實施方案1所述的抗體組合物。

24、5.一種測定肉毒桿菌毒素活性的方法，包括以下步驟：

25、(a)用肉毒桿菌毒素處理神經元細胞；和

26、(b)通過實施方案1所述的抗體測量神經元細胞中的snap25fl或snap25197，其中所述肉毒桿菌毒素是肉毒桿菌毒素血清型a。

27、在本發明的一個實施方案中，“肉毒桿菌毒素(botulinum?toxin)”是由肉毒桿菌(clostridium?botulinum)產生的神經毒性蛋白。梭菌屬超過127多種，根據其形態和功能進行分類。肉毒桿菌毒素，一種由厭氧，革蘭氏陽性菌肉毒桿菌(clostridium?botulinum)產生的強效多肽神經毒素，導致人類和動物的神經麻痹性疾病稱為肉毒桿菌中毒。肉毒桿菌(clostridium?botulinum)的孢子可以在土壤中發現，并可以培養在未經消毒和密封的家庭罐裝食品容器中，這是許多肉毒桿菌中毒病例的原因。肉毒桿菌中毒的癥狀通常在食用被肉毒桿菌培養物或孢子感染的食物后18至36小時出現。肉毒桿菌毒素似乎能夠通過腸壁而不降低其毒性，并且對膽堿能運動神經元具有高親和力。肉毒桿菌毒素中毒的癥狀可能從行走，吞咽和說話困難發展為呼吸肌麻痹甚至死亡。a型肉毒桿菌毒素是人類已知的最致命的天然生物劑。市售a型肉毒桿菌毒素(純化的神經毒素復合物)的ld50約為50皮克(即1個單位)。在摩爾(m)基礎上，a型肉毒桿菌毒素約比白喉致死性高18億倍，約比氰化鈉致死性高6億倍，約比眼鏡蛇毒素(cobra?toxin)致死性高3000萬倍，約比霍亂致死性高1200萬倍。一個單位(u)的肉毒桿菌毒素可被定義為通過腹膜內注射給每只體重18至20克的雌性瑞士韋伯斯特(swiss?webster)小鼠的ld50。7種不同的肉毒桿菌神經毒素在免疫學上通常被分別描述為神經毒素血清型(serotype)a、b、c1、d、e、f和g，每一種血清型通過中和類型特異性抗體來區分。血清型肉毒桿菌毒素的不同取決于它們所作用的動物種類以及它們引起的麻痹的嚴重程度和持續時間。例如，根據大鼠麻痹率的測定，a型肉毒毒素的效力是b型肉毒毒素的500倍。另外，b型肉毒桿菌毒素的劑量為480u/kg時仍被測定為對靈長類無毒，約a型肉毒桿菌毒素對靈長類ld50的12倍。肉毒桿菌毒素被認為與膽堿能運動神經元有明顯的高親和性結合，能進入神經元并阻斷乙酰膽堿的釋放。額外的吸收可以通過低親和力受體以及吞噬作用和胞飲作用發生。無論血清型如何，毒素中毒的分子機制似乎是相似的，并且涉及至少3步。在該過程的第一步，毒素通過毒素的重鏈(h鏈或hc)和細胞表面受體之間的特定相互作用與目標神經元的突觸前膜結合。每種類型的肉毒桿菌毒素和破傷風毒素的受體被認為是不同的。hc的羧基末端段似乎對于將肉毒桿菌毒素靶向細胞表面很重要。

28、第二步，肉毒桿菌毒素穿過靶細胞的質膜。肉毒桿菌毒素首先通過受體介導的內吞作用被細胞吞噬，形成含有肉毒桿菌毒素的內體。然后毒素從內體逃逸到細胞的細胞質中。該步驟被認為是由重鏈的氨基末端片段hn介導的，hn會觸發毒素的構象變化以響應約5.5的ph值。已知內體具有質子泵，可降低內體內的ph值。構象轉變暴露了毒素中的疏水殘基，這使得肉毒桿菌毒素能夠將自身嵌入內體膜中。隨后肉毒桿菌毒素(或至少肉毒桿菌毒素的輕鏈)通過內體膜轉移到細胞質中。肉毒桿菌毒素活性機制的最后一步被認為涉及連接重鏈和輕鏈的二硫鍵的還原。肉毒桿菌和破傷風毒素的全部毒性活性都包含在全毒素的輕鏈中；輕鏈是一種鋅(zn++)中性內肽酶，選擇性裂解含有神經遞質的囊泡與質膜的細胞質表面的識別和對接以及囊泡與質膜的融合所必需的蛋白。破傷風神經毒素,b、d、f和g型肉毒桿菌毒素會導致突觸小體蛋白(也稱為囊泡相關膜蛋白(vamp))(一種突觸體膜蛋白)降解。任何一個這些降解過程的結果是，存在于突觸小泡細胞質表面的大部分vamp被去除。血清型a和e裂解snap-25。血清型c1最初被認為可以切割突觸融合蛋白(syntaxin)，但發現它可以切割突觸融合蛋白和snap-25。除了b型肉毒桿菌毒素(和破傷風毒素)裂解相同的鍵之外，每種毒素都特異性地裂解不同的鍵。這些裂解中的每一個都會阻止囊泡-膜對接的過程，從而防止囊泡內容物的胞吐作用。

29、肉毒桿菌毒素已用于臨床環境中，用于治療以骨骼肌過度活躍(即運動障礙)為特征的神經肌肉疾病。1989年，一種a型肉毒桿菌毒素復合物被美國食品和藥物管理局批準用于治療眼瞼痙攣、斜視和面肌痙攣。隨后，a型肉毒桿菌毒素也被fda批準用于治療頸肌張力障礙和眉間紋，而b型肉毒桿菌毒素也被批準用于治療頸肌張力障礙。與a型肉毒桿菌毒素相比，非a型肉毒桿菌毒素血清型顯然具有較低的效力和/或較短的活性持續時間。外周肌內a型肉毒桿菌毒素的臨床效果通常在注射后一周內出現。單次肌肉注射a型肉毒桿菌毒素后癥狀緩解的典型持續時間平均約為3個月，但據報道治療活性的時間明顯更長。

30、盡管所有肉毒桿菌毒素血清型都明顯抑制神經肌肉接頭處神經遞質乙酰膽堿的釋放，但它們是通過影響不同的神經分泌蛋白并在不同位點切割這些蛋白來實現的。例如，a型和e型肉毒桿菌都能切割25kda突觸體相關蛋白(snap-25)，但它們靶向該蛋白內的不同氨基酸序列。b、d、f和g型肉毒桿菌毒素作用于囊泡相關膜蛋白(vamp，也稱為小突觸囊泡蛋白(synaptobrevin))，每種血清型切割蛋白的不同位點。最后，c1型肉毒桿菌毒素似乎同時切割突觸融合蛋白和snap-25。這些作用機制的差異可能會影響各種肉毒桿菌毒素血清型的相對效力和/或作用持續時間。特別地，肉毒桿菌毒素的底物可以在多種不同的細胞類型中找到。

31、對于所有七種已知的肉毒桿菌毒素血清型，肉毒桿菌毒素的分子量約為150kda。肉毒桿菌毒素作為復合物被梭菌屬(clostridial?bacterium)釋放，該復合物包含150kda的肉毒桿菌毒素蛋白分子以及相關的非毒素蛋白。因此，a型肉毒桿菌毒素復合物可以由梭菌屬以900kda、500kda或300kda的大小產生。b型和c1型肉毒桿菌毒素顯然僅作為700kda或500kda復合物產生。b型和c1型肉毒桿菌毒素作為300kda或500kda復合物產生。最后，e型和f型肉毒桿菌毒素僅作為約300kda的復合物產生。復合物(即分子量大于約150kda)被認為含有非毒素血凝素蛋白、非毒素和非毒素非血凝素蛋白。這兩種非毒素蛋白(與肉毒桿菌毒素分子一起構成相關的神經毒素復合物)可以起到提供穩定性的作用，防止肉毒桿菌毒素分子發生變性，并在攝入肉毒桿菌毒素時防止消化酸作用。此外，較大(大于約150kda分子量)的肉毒桿菌毒素復合物可能導致肉毒桿菌毒素從肉毒桿菌毒素復合物的肌內注射部位擴散的速度較慢。因此，在本發明中，肉毒桿菌毒素可以包括不含復合蛋白的形式和含有復合蛋白的復合物形式。源自a、b、c、d、e、f或g型肉毒桿菌的不含天然復合蛋白的肉毒桿菌毒素蛋白分子量約為150kda。然而，當毒素蛋白由肉毒桿菌產生時，肉毒毒素蛋白與各種血凝素和非血凝素蛋白形成的各種復合物能夠支持和保護肉毒毒素蛋白的作用。肉毒桿菌毒素血清型a含有天然存在的復合蛋白，呈復合物形式，分子量約為900kda、500kda或300kda，血清型b和c呈復合物形式，分子量約為500kda，血清型d呈復合物形式，分子量約為300kda或500kda，血清型e和f呈復合物形式，分子量約為300kda。

32、此外體外研究表明，肉毒桿菌毒素抑制鉀陽離子誘導的乙酰膽堿和去甲腎上腺素從腦干組織的原代細胞培養物中釋放。此外，據報道，肉毒桿菌毒素抑制脊髓神經元原代培養物中甘氨酸和谷氨酸的誘發釋放，并且在腦突觸體制劑中，肉毒桿菌毒素抑制神經遞質乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、cgrp、p物質和谷氨酸鹽的釋放。因此，當使用足夠的濃度時，大多數神經遞質的刺激誘發釋放可以被肉毒桿菌毒素阻斷。

33、a型肉毒桿菌毒素可以通過在發酵罐中建立和培養肉毒桿菌的培養物，然后根據已知步驟收獲和純化發酵混合物來獲得。所有肉毒桿菌毒素血清型最初都是作為無活性的單鏈蛋白合成的，必須被蛋白酶切割或切開才能具有神經活性。產生肉毒桿菌毒素血清型a和g的細菌菌株具有內源性蛋白酶，因此，血清型a和g可以從細菌培養物中以主要活性形式回收。相比之下，肉毒桿菌毒素血清型c1、d和e是由非蛋白水解菌株合成的，因此在從培養物中回收時通常會失活。血清型b和f可以由蛋白水解和非蛋白水解菌株產生，因此可以以活性或非活性形式回收。然而，即使是產生例如b型肉毒桿菌毒素血清型的蛋白水解菌株，也只能切割一部分產生的毒素。切口分子與無切口分子的確切比例取決于培養時間和培養溫度。因此，眾所周知，任何制劑的一定比例，例如b型肉毒桿菌毒素可能是無活性的，這可能是由于與a型肉毒桿菌毒素相比，b型肉毒桿菌毒素效力顯著較低的原因。在臨床制劑中無活性的肉毒桿菌毒素分子的存在會增加制劑的總蛋白負荷，這與抗原性增加有關，但不會影響其臨床療效。此外，已知b型肉毒桿菌毒素在肌內注射時具有更短的活性持續時間并且在相同劑量水平下也比a型肉毒桿菌毒素活性更弱。

34、可以從hall?a肉毒桿菌菌株中獲得a型肉毒桿菌毒素的高質量結晶，其特征為≥3×107u/mg，a260/a278小于或等于0.60，并且在凝膠電泳中有明顯的條帶化模式。已知的schantz法可用于獲得結晶a型肉毒桿菌毒素。通常，a型肉毒桿菌毒素復合物可通過在合適的培養基中培養a型肉毒桿菌而從厭氧發酵中分離和純化。已知的方法也可以用于從非毒素蛋白中分離以獲得純肉毒桿菌毒素，例如：純化的a型肉毒桿菌毒素，分子量約為150kda，比效力為1-2x?108ld50?u/mg或更高；純化的b型肉毒桿菌毒素，分子量約為156kda，比效力為1-2×108ld50u/mg或更高，以及純化的f型肉毒桿菌毒素，分子量約為155kda，比效力為1-2×107ld50u/mg或更高。

35、肉毒桿菌毒素和/或肉毒桿菌毒素復合物可從本領域已知的化合物制造商商購獲得，并且純肉毒桿菌毒素也可用于制備藥物組合物。

36、與酶一樣，肉毒桿菌毒素(它們是細胞內肽酶)的生物活性至少部分依賴于它們的三維構象。因此，a型肉毒桿菌毒素通過加熱、不同化學品表面拉伸和表面干燥而解毒。此外，已知將通過已知培養、發酵和純化獲得的肉毒桿菌毒素復合物稀釋至非常低的毒素濃度用于藥物組合物制劑，會導致毒素的快速解毒，除非存在合適的穩定劑。將毒素從毫克量稀釋到每毫升含有納克的溶液存在很大的困難，因為在如此大的稀釋下特異性毒性會迅速喪失。由于肉毒桿菌毒素可在含毒素的藥物組合物配制后數月或數年使用，因此應使用合適的穩定劑穩定毒素。因此，如本發明所公開的，需要開發最佳穩定劑技術以控制肉毒桿菌毒素在體內以緩釋形式釋放。

37、據報道，a型肉毒桿菌毒素已經在如下的臨床環境中被應用：

38、體內肌內注射一次肉毒桿菌毒素的通常持續時間通常為約3至4個月。但是，在某些情況下，a亞型肉毒桿菌毒素在用于治療腺，例如治療多汗癥時，其效力可長達12個月，在某些情況下長達27個月。

39、除了在外周部位具有藥理作用外，肉毒桿菌毒素甚至在中樞神經系統中也可能表現出抑制作用，并且能夠通過逆行運輸上升到脊柱區域。因此，在外周位置(例如肌肉內)注射的肉毒桿菌毒素可以逆行運輸到脊髓。

40、肉毒桿菌毒素也已被提議用于或已被用于治療皮膚、骨骼和肌腱傷口、鞘內疼痛、各種自主神經疾病，包括汗腺疾病、緊張性頭痛、偏頭痛、術后疼痛和內臟疼痛、頭發生長和防止脫發、牛皮癬和皮炎、肌肉損傷、各種癌癥、平滑肌疾病、神經卡壓綜合征、痤瘡、神經源性炎癥、視神經疾病、胰腺疾病、前列腺疾病，包括前列腺增生、前列腺癌和尿失禁、纖維肌痛和梨狀肌綜合癥。還已知與特定靶向部分化學綴合或重組融合的經修飾的梭菌神經毒素或其片段，優選肉毒桿菌毒素，可作為藥劑施用于脊髓來治療疼痛。此外，眾所周知，靶向肉毒桿菌毒素(即具有非天然結合部分)可用于治療各種疾病。此外，已將肉毒桿菌毒素注射到胸肌中以控制胸肌痙攣。毒素植入物的控制釋放是已知的，例如肉毒桿菌毒素經皮給藥的情況。眾所周知，肉毒桿菌毒素可用于：削弱口腔的咀嚼或咬肌，使自身造成的傷口和由此產生的潰瘍愈合，使良性囊性病變或腫瘤愈合；治療肛裂，以及治療某些類型的特應性皮炎。此外，肉毒桿菌毒素可能具有減輕大鼠福爾馬林模型中誘發的炎性疼痛的作用。此外，據報道，肉毒桿菌毒素神經阻滯可導致表皮厚度減少。最后，已知肉毒桿菌毒素可施用于足部以治療足部過度出汗、腳趾痙攣、特發性足趾行走和足部肌張力障礙。

41、破傷風毒素(tetanus?toxin)，及其衍生物(即具有非天然靶向部分)，其片段，雜化和嵌合體也可以具有治療用途。破傷風毒素與肉毒桿菌毒素有許多相似之處。因此，破傷風毒素和肉毒桿菌毒素都是由密切相關的梭狀芽孢桿菌(破傷風梭菌(clostridiumtetani)和肉毒梭菌(clostridium?botulinum))制成的多肽。此外，破傷風毒素和肉毒桿菌毒素都是由輕鏈(分子量：約50kda)通過單個二硫鍵共價結合至重鏈(分子量：約100kda)組成的雙鏈蛋白。因此，破傷風毒素和7種肉毒桿菌毒素(非復合)中的每一種的分子量約為150kda。此外，對于破傷風毒素和肉毒桿菌毒素，輕鏈具有顯示細胞內生物(蛋白酶)活性的結構域，而重鏈包含受體結合(免疫原性)和細胞膜電位域。此外，破傷風毒素和肉毒桿菌毒素都對突觸前膽堿能神經元表面的神經節苷脂受體(ganglioside?receptors)表現出高特異性親和力。外周膽堿能神經元中受體介導的破傷風毒素內吞作用導致軸突逆行轉運，阻斷中樞突觸釋放抑制性神經遞質，并導致痙攣性麻痹。相反，據信受體介導的肉毒桿菌毒素在外周膽堿能神經元中的內吞作用幾乎不會導致逆行轉運、抑制來自中毒外周運動神經元的乙酰膽堿胞吐作用和弛緩性麻痹。最后，破傷風毒素和肉毒桿菌毒素在生物合成和分子結構方面彼此相似。因此，破傷風毒素和a型肉毒桿菌毒素的蛋白序列之間的總體同一性為34％，某些功能域的序列同一性高達62％。

42、在本發明的一個實施方案中，“乙酰膽堿”是膽堿和乙酸的酯，它是第一種已知的神經遞質。它分布于整個神經元中，化學式為c7h16no2，分子量為146.21kda。

43、通常，哺乳動物神經系統中的每種類型的神經元僅釋放一種類型的小分子神經遞質，盡管有證據表明同一神經元可以釋放多種神經調節劑。神經遞質乙酰膽堿由大腦許多區域的神經元分泌，特別是由運動皮層的大錐體細胞、基底神經節中的幾個不同神經元、支配骨骼肌的運動神經元、自主神經系統的節前神經元分泌(交感神經和副交感神經)、肌梭纖維的第1袋狀纖維、副交感神經系統的節后神經元和交感神經系統的部分節后神經元。從本質上講，只有到汗腺、立毛肌和少數血管的節后交感神經纖維是膽堿能的，因為交感神經系統的大多數節后神經元會分泌神經遞質去甲腎上腺素。在大多數情況下，乙酰膽堿具有興奮作用。然而，已知乙酰膽堿對一些外周副交感神經末梢具有抑制作用(例如，迷走神經抑制心率)。自主神經系統的傳出信號通過交感神經系統或副交感神經系統傳遞到身體。交感神經系統的節前神經元從位于脊髓中外側角的節前交感神經元胞體延伸。從細胞體延伸出來的節前交感神經纖維與位于椎旁交感神經節或椎前神經節中的節后神經元形成突觸。由于交感神經和副交感神經系統的節前神經元都是膽堿能的，因此將乙酰膽堿應用于神經節將同時激發交感神經和副交感神經節后神經元。乙酰膽堿激活兩種類型的受體，毒蕈堿和煙堿受體。毒蕈堿受體存在于由副交感神經系統的節后神經元刺激的所有效應細胞以及由交感神經系統的節后膽堿能神經元刺激的效應細胞中。煙堿受體存在于腎上腺髓質以及自主神經節內，即在交感神經和副交感神經系統的節前和節后神經元之間的突觸處的節后神經元的細胞表面上。在許多非自主神經末梢中也發現了煙堿受體，例如在神經肌肉接頭處的骨骼肌纖維膜中。當小的、透明的細胞內囊泡與突觸前神經元細胞膜融合時，乙酰膽堿從膽堿能神經元中釋放出來。多種非神經元分泌細胞，例如腎上腺髓質(以及pc12細胞系)和胰島細胞，分別從大的密集核囊泡中釋放兒茶酚胺和甲狀旁腺激素。pc12細胞系是大鼠嗜鉻細胞瘤細胞的克隆，廣泛用作研究交感腎上腺發育的組織培養模型。當去神經支配的細胞被透化(如通過電穿孔)或直接注射毒素時，肉毒桿菌毒素抑制兩種類型的化合物在體外從兩種類型的細胞中釋放。肉毒桿菌毒素也已知會阻止神經遞質谷氨酸鹽從皮質突觸體細胞培養物中的釋放。通過軸突與肌肉細胞的接近，在骨骼肌中形成神經肌肉接頭。通過神經系統傳遞的信號在末端軸突產生動作電位，激活離子通道并導致神經遞質乙酰膽堿從神經元內突觸囊泡中釋放，例如在神經肌肉接頭的運動終板處。乙酰膽堿穿過細胞外空間與肌肉終板表面的乙酰膽堿受體蛋白結合。一旦發生足夠的結合，肌細胞的動作電位會引起特定的膜離子通道變化，從而導致肌細胞收縮。然后乙酰膽堿從肌肉細胞中釋放出來，并被細胞外空間中的膽堿酯酶代謝。代謝物被循環回末端軸突，用于再加工成進一步的乙酰膽堿。

44、在本發明的一個實施方式中，“毒素的活性”是指肉毒桿菌毒素的內在效力，是指通過小鼠ld50生物測定(mld50)(一種標準測定方法)測量1u(1單位)肉毒桿菌毒素時，體重18-20g小鼠的死亡率為50％。肉毒桿菌毒素，特別是a型肉毒桿菌毒素，是人類已知的最致命的天然生物制劑，其致死率是白喉毒素的18億倍，是氰化鈉的6億倍，是眼鏡蛇毒素的3000萬倍，是霍亂毒素的1200萬倍。因此，約20％效力的肉毒桿菌毒素差異將導致效果上的顯著差異，例如白喉毒素的3.6億倍，或霍亂毒素的240萬倍。

45、用于醫療或美容目的的肉毒桿菌毒素制劑通常以凍干制劑或液體制劑的形式銷售，其問題在于，由于肉毒桿菌毒素本身是一種蛋白，其活性因溫度、ph值、光、物理沖擊或氣體(空氣、氮氣、氧氣等)而變得非常不穩定。當肉毒桿菌毒素的效價如上所述降低時，幾乎無法發揮其預期的效果，因此必須在制備步驟或使用步驟中準確預測肉毒桿菌毒素的效價。

46、在本發明的一個實施方案中，“抗體”是本領域已知的術語并且指針對抗原位點的特定蛋白分子。對于本發明的目的，抗體是指與snap25蛋白特異性結合的抗體。該抗體可以根據常規方法產生。本發明的抗體包括可由蛋白產生的部分肽，并且本發明的部分肽包含至少7個氨基酸，優選至少9個氨基酸，更優選至少12個氨基酸。本發明的抗體的形式沒有特別限制，本發明的抗體包括具有抗原結合能力的多克隆抗體、單克隆抗體或其部分，以及本發明的抗體包括所有的免疫球蛋白抗體。此外，本發明的抗體還包括人源化抗體等特殊抗體。本發明的抗體不僅包括具有輕鏈和重鏈的完整抗體，還包括抗體分子的功能片段。表述“抗體分子的功能片段”是指至少具有抗原結合能力的片段，功能片段的實例包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv等。

47、在本發明的一個實施例中，術語“試劑盒”是指一組用于特定目的所需的組合物和配件。就本發明的目的而言，本發明的試劑盒包含與snap25fl或snap25197特異性結合的抗體，或包含該抗體的組合物，或包被有該抗體的細胞培養皿，以測量肉毒桿菌毒素的活性。

48、在本發明的一個實施方案中，提供了一種細胞系，其克隆選自親本神經元細胞系neu?ro-2a。

49、本發明人從13個不同的神經元細胞系中選擇了對肉毒桿菌毒素具有敏感性的neuro-2a細胞，其與sima細胞系的敏感性相似，最終通過克隆選擇過程從neuro-2a細胞中選擇了n2-42f(登錄號：kctc?13712bp)，其均顯示對肉毒桿菌毒素高度敏感性，從而完成本發明。

50、本發明中的細胞系可用于確定肉毒桿菌毒素的活性或檢測肉毒桿菌毒素。

51、即使傳代繼續，本發明的細胞系仍保持其對肉毒桿菌毒素的敏感性，因此非常適合用于基于細胞的測定平臺。

52、根據本發明的用于確定肉毒桿菌毒素活性的細胞系是指從對應于包括各種類型細胞的群體的親代神經元細胞系中分離的均質單細胞，并且是指具有共同遺傳特征的細胞，例如特定基因的基因表達水平高或低等。

53、用于測定肉毒桿菌毒素活性的細胞系可以通過克隆選擇等方法從親本神經元細胞系中分離出來，也可以通過調節基因的表達水平產生。基因表達水平的調控可以通過常規的基因表達調控方法實現，例如轉化、啟動子操作等。

54、本發明的親本神經元細胞系可以包括任何來源于神經的永生化細胞系，優選neuro-2a細胞，更優選neuro-2a細胞(保藏號：kctc?ac28106)，但不限于此。neuro-2a細胞是小鼠神經元細胞，一般可用于測定ld50，用于測定肉毒桿菌毒素活性的常規sima細胞的倍增時間為34-100小時，而neuro-2a細胞的倍增時間僅為24小時，表明neuro-2a細胞不僅非常適合肉毒桿菌毒素活性的細胞測定，也非常適合用于肉毒桿菌毒素的檢測。此外，當用顯微鏡觀察時，neuro-2a細胞對應的是一個包含各種類型細胞的群體，因此非常適合從中選擇對肉毒桿菌毒素更敏感的單個細胞。

55、本發明的細胞系從親本神經元細胞系neuro-2a中克隆選出，可以是n2-42f(登錄號：k?ctc?13712bp)，但不限于此。

56、本發明用于測定肉毒桿菌毒素活性的細胞系可用于檢測肉毒桿菌毒素或測定其活性。該細胞系對肉毒桿菌毒素敏感，因此可以檢測目標樣品中是否存在肉毒桿菌毒素，還可以根據肉毒桿菌毒素的濃度來測量肉毒桿菌毒素的毒性程度。

57、本發明的肉毒桿菌毒素是肉毒梭菌產生的神經毒蛋白，可分為a、b、c(c1、c2)、d、e、f、g七種血清型。肉毒桿菌毒素根據血清型影響不同的神經分泌蛋白，并在不同位點切割這些蛋白。具體來說，肉毒桿菌毒素血清型a和e都可以切割snap25(突觸體神經相關蛋白25)，而肉毒桿菌毒素血清型b、d、f和g可以切割vamp(囊泡相關膜蛋白)，而肉毒桿菌毒素血清型c1可以切割突觸融合蛋白和snap25，從而誘導神經毒性。優選地，肉毒桿菌毒素可以是肉毒桿菌毒素血清型a或肉毒桿菌毒素血清型b，更優選肉毒桿菌毒素血清型a，但不限于此。

58、由于本發明的肉毒桿菌毒素血清型a和b被純化并廣泛用于治療肌張力障礙、美容應用等，因此當本發明用于測定肉毒桿菌毒素活性的細胞系用于測量肉毒桿菌毒素的效力時，優勢在于可以確定可能發生副作用的濃度，從而解決當肉毒桿菌毒素用于上述應用時可能出現的問題。

59、在本發明的另一個實施方案中，提供了用于確定肉毒桿菌毒素活性的基于細胞的方法。

60、本發明的方法包括以下步驟：培養根據本發明的細胞系；用肉毒桿菌毒素處理培養的細胞系；并測量經肉毒桿菌毒素處理的細胞系對肉毒桿菌毒素的敏感性。

61、本發明的基于細胞的確定肉毒桿菌毒素活性的方法可以通過用肉毒桿菌毒素處理用于確定肉毒桿菌毒素活性的細胞系，并測量該細胞系對肉毒桿菌毒素的敏感性來實現。因此，為了避免根據重復描述的說明書的過度復雜性，省略了為了確定肉毒桿菌毒素活性的細胞系，肉毒桿菌毒素，被肉毒桿菌毒素切割的神經分泌蛋白，親代神經元細胞系等有關的內容。

62、在培養本發明中培養細胞系的步驟中，細胞系的培養可以在包被有聚-d-賴氨酸的培養板中進行。與使用通常用于培養細胞系的平板或涂有明膠或膠原蛋白的平板相比，當使用包被有聚-d-賴氨酸的板時，根據本發明的細胞系可以均勻地分布，牢固地附著并保持健康的細胞狀態。

63、在本發明中測量細胞系對肉毒桿菌毒素的敏感性的步驟可以包括測量由肉毒桿菌毒素引起的內源性神經分泌蛋白的裂解。具體而言，在肉毒桿菌毒素血清型a和肉毒桿菌血清型e的情況下，可以測定snap25的切割，在肉毒桿菌毒素血清型b，d，f和g的情況下，可以測定vamp的切割，對于肉毒桿菌毒素血清型c1，可以測定突觸融合蛋白和/或snap?25的切割。

64、本發明中的切割的測定可以通過使用對內源性神經分泌蛋白的裂解肽具有特異性的抗體等檢測蛋白的方法來實現。

65、本發明的抗體是指可以將神經分泌蛋白的全部或裂解的肽識別為抗原并且可以與神經分泌蛋白特異性結合的蛋白分子，其實例包括多克隆抗體，單克隆抗體和重組抗體。

66、檢測本發明的蛋白的方法可以是用于檢測蛋白的任何常規方法，其實例包括但不限于western印跡測定，elisa(酶聯免疫吸附測定)，ria(放射免疫測量)，放射免疫擴散，歐氏(ouchterlony)免疫雙擴散法，火箭(rocket)免疫電泳測定法，免疫組化染色，免疫沉淀測定，補體結合實驗，熒光激活細胞分選儀(facs)，蛋白質芯片等。

67、在本發明的另一個實施方案中，提供了一種用于檢測肉毒桿菌毒素的基于細胞的方法。

68、本發明的方法包括以下步驟：培養根據本發明的細胞系；用感興趣的樣品處理培養的細胞系；并且測量樣品處理的細胞系對肉毒桿菌毒素的敏感性。

69、根據本發明的用于檢測肉毒桿菌毒素的基于細胞的方法可以通過用感興趣的樣品代替肉毒桿菌毒素處理細胞系來實現，用于確定肉毒桿菌毒素活性的基于細胞的方法中，并且測量細胞系對肉毒桿菌毒素的敏感性。因此，為了避免根據重復描述的說明書的過度復雜性，省略了為了確定肉毒桿菌毒素活性的細胞系，肉毒桿菌毒素，被肉毒桿菌毒素切割的神經分泌蛋白，親代神經元細胞系，包被板，蛋白質檢測方法，抗體等有關的內容。

70、用于本發明的目的樣品是預期包含肉毒桿菌毒素的樣品，其實例可以包括生物學樣品，包括細胞培養上清液，血液，唾液，痰，腦脊髓液，分泌物，淋巴液，透析液，體液，尿液等，以及含有化合物的化學樣品。

71、在本發明的又一個實施方案中，提供了一種抗體，其特異性地結合snap25，其中snap25是snap25fl或snap25197，并且該抗體具有seq?id?no：11至13,28至33，55至56所示的重鏈cdr1區域；選自下組任一所示的重鏈cdr2區域：seq?id?no：14至16,34至39,57至58；選自下組任一所示的重鏈cdr3區域：seq?id?no：17至19,40至46和59到60；選自下組任一所示的輕鏈cdr1區域：seq?id?no：20至22,47至49和61至62；選自下組任一所示的輕鏈cdr2區域：seq?id?no：23至24,50至51和63至64；選自下組任一所示的輕鏈cdr3區域：seq?id?no：25至27,52至54和65至66。

72、更具體地，抗體優選是特異性結合snap25fl的抗體，其中，由seq?id?no：11所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：14所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：17所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：20所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：23所示的輕鏈cdr2區域；和由seqid?no：25所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：83和84所示的抗體，但不限于此。

73、此外，抗體優選是特異性結合snap25fl的抗體，其中：由seq?id?no：12所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：15所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：18所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：21所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：24所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：26所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?idno：87和88所示的抗體，但不限于此。

74、另外地，抗體優選是特異性結合snap25fl的抗體其中：由seq?id?no：13所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：16所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：19所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：22所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：24所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：27所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?idno：89和90所示的抗體，但不限于此。

75、此外，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：28所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：34所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：40所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：47所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：52所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：71和72所示的抗體，但不限于此。

76、此外，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：29所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：35所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：41所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：48所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：52所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：73和74所示的抗體，但不限于此。

77、此外，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：29所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：36所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：42所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：47所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：52所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：75和76所示的抗體，但不限于此。

78、此外，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：33所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：35所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：43所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：48所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：52所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：77和78所示的抗體，但不限于此。

79、此外，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：30所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：37所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：44所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：48所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：52所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：79和80所示的抗體，但不限于此。

80、更，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：31所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：38所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：45所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：47所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：53所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?idno：81和82所示的抗體，但不限于此。

81、此外，抗體優選是特異性結合snap25197的抗體，其中：由seq?id?no：32所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：39所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：46所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：49所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：51所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：54所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：85和86所示的抗體，但不限于此。

82、另外，抗體優選是與snap25fl和snap25197特異性結合的抗體，其中seq?id?no：55所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：57所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：59所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：61所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：63所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：65所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：67和68所示的抗體，但不限于此。

83、另外，抗體優選是與snap25fl和snap25197特異性結合的抗體，其中seq?id?no：56所示的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：58所示的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：60所示的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：62所示的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：64所示的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：66所示的輕鏈cdr3區域。更具體地，抗體可以是由seq?id?no：69和70所示的抗體，但不限于此。

84、在本發明的又一個實施方案中，提供了包含抗體的抗體組合物，或包被有抗體的培養皿，或包含抗體組合物或培養皿的試劑盒。

85、在本發明的另一個實施方案中，提供了能夠產生抗體的雜交瘤細胞，其中所述雜交瘤細胞是注射有選自下組：seq?id?no：1至10的任何一種或多種肽的小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞的融合體。

86、在本發明的又一個實施方案中，提供了一種用于確定肉毒桿菌毒素的活性的方法，包括以下步驟：(a)用肉毒桿菌毒素處理神經元細胞；(b)通過選自seq?id?no：67至90所示的抗體中的一種或多種抗體來測量神經元細胞中的snap25fl或snap25197，其中肉毒桿菌毒素是a型肉毒桿菌毒素。

87、在本發明的又一個實施方案中，提供了一種檢測肉毒桿菌毒素的方法，包括以下步驟：(a)將目標樣本處理成神經細胞；(b)通過選自seq?id?no:67至8，seq?id?no:85，或seq?id?no:86所示的抗體中的一種或多種抗體來測量神經元細胞中的snap25197；以及(c)確定當測量snap25197時，樣品中存在肉毒桿菌毒素，其中肉毒桿菌毒素是a型肉毒桿菌毒素。

88、在本發明的又一個實施方案中，提供了一種基于細胞的方法來分析神經毒素滴度，包括以下步驟：(a)培養neuro-2a衍生的神經元細胞系；(b)用神經毒素處理神經元細胞系；(c)用特異性地結合snap25fl和snap25197的抗體處理獲自神經元細胞系的神經元細胞系或樣品；以及(d)用特異性地結合snap25197但不結合snap25fl的抗體處理步驟(c)的神經元細胞系(c)，所述neuro-2a衍生的細胞系是n2-42f細胞系(登錄號：kctc?13712bp)，神經毒素是肉毒桿菌毒素，以及步驟(b)中的神經毒素用含gt1b(神經節苷脂gt1b三鈉鹽)的培養基稀釋，并用于處理細胞系。

89、用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(c)中使用的抗體包括：由seqid?no：55或56組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：57或58組成的重鏈cdr2區域；由seq?idno：59或60組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：61或62組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：63或64組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：65或66組成的輕鏈cdr3區域。更具體地，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(c)中使用的抗體包括：由seq?id?no：55組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：57組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：59組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：61組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：63組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：65組成的輕鏈cdr3區域。另外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(c)中使用的抗體包括：由seq?id?no：56組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：58組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：60組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：62組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：64組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：66組成的輕鏈cdr3區域。

90、此外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：選自下組任一所示的重鏈cdr1區域：seq?id?no：28至33；選自下組任一所示的重鏈cdr2區域：seq?id?no：34至39；選自下組任一所示的重鏈cdr3區域：seq?id?no：40至46；選自下組任一所示的輕鏈cdr1區域：seq?id?no：47至49；選自下組任一所示的輕鏈cdr2區域：seq?idno：50至51；選自下組任一所示的輕鏈cdr3區域：seq?id?no：52至54。更具體地，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seq?id?no：28組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：34組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：40組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：47組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?idno：52組成的輕鏈cdr3區域。另外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seq?id?no：29組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：35組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：41組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：48組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：52組成的輕鏈cdr3區域。另外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seq?id?no：29組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：36組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：42組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：47組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：52組成的輕鏈cdr3區域。此外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seqid?no：33組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：35組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：43組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：48組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：52組成的輕鏈cdr3區域。另外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seq?id?no：30組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：37組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：44組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：48組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：52組成的輕鏈cdr3區域。另外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seq?id?no：31組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：38組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：45組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：47組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：50組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：53組成的輕鏈cdr3區域。另外，用于分析神經毒素效力的基于細胞的方法中的步驟(d)中使用的抗體包括：由seq?idno：32組成的重鏈cdr1區域；由seq?id?no：39組成的重鏈cdr2區域；由seq?id?no：46組成的重鏈cdr3區域；由seq?id?no：49組成的輕鏈cdr1區域；由seq?id?no：51組成的輕鏈cdr2區域；和由seq?id?no：54組成的輕鏈cdr3區域。

91、在本發明的又一個實施方案中，提供了用于用神經毒素處理神經元細胞的細胞培養基，所述細胞培養基包含gt1b(神經節苷脂gt1b三鈉鹽)。細胞培養基中gt1b的濃度可以是25至75μg/ml，細胞培養基進一步含有肌酸和精氨酸。此外，細胞培養基中肌酸濃度可以是0.1至10mm，細胞培養基中的精氨酸濃度可以是0.5至50mm。另外，細胞培養基可以是rpmi1640(roswell?park?memorial?institute?1640)培養基。

92、在下文中，將詳細描述本發明的每個步驟。

93、【有利效果】

94、近年來，出于醫學和美容目的對肉毒桿菌毒素的需求迅速增加，但是還沒有穩定且可重現的用于測量肉毒桿菌毒素滴度的基于細胞的滴度測定方法。由于肉毒桿菌毒素是一種非常強效的神經毒素蛋白，特別需要開發高度特異性和靈敏的細胞和抗體以用于基于細胞的肉毒毒素效力的精確測量。

95、本發明涉及用于確定肉毒桿菌毒素活性的抗體和包含該抗體的抗體組合物。與用于確定肉毒桿菌毒素活性或檢測肉毒桿菌毒素的常規sima細胞相比，本發明的新型細胞系具有顯著縮短的倍增時間，并且與親代細胞系相比，其對肉毒桿菌毒素具有顯著高的敏感性，表明它非常適合基于細胞的肉毒桿菌毒素活性的測定或檢測。此外，根據本發明的細胞系可以附著在包被有聚-d-賴氨酸(pdl)的培養皿中穩定培養，因此可以非常有效地用于基于細胞的肉毒桿菌毒素活性的測定或檢測。

96、根據本發明的抗肉毒桿菌毒素抗體是對有①snap25fl,②snap25197,或③snap25fl和snap25197,具有結合特異性的單克隆抗體,具有顯著優異的特異性和敏感性。因此,預計廣泛用于制藥及美容領域。

97、此外，本發明涉及使用n2-42f細胞和對snap25具有顯著高的結合親和力和特異性的單克隆抗體的最佳cbpa測定法，并且該cbpa可以測量0.5u或以下的肉毒桿菌毒素的滴度。使用本發明的細胞和抗體的cbpa測定有望成為具有高可靠性和再現性的肉毒毒素的基于細胞的滴度測定。

98、【附圖簡要說明】

99、圖1顯示了根據本發明的一個實施方式，在神經元細胞中測量對肉毒桿菌毒素a(bont/a)的敏感性的western印跡分析的結果。泳道m代表蛋白質大小標記；泳道1代表無bont/a毒素的總細胞裂解物中snap25蛋白的表達水平；泳道2代表有bont/a毒素的總細胞裂解物中snap25蛋白的表達水平。此外，n2a代表neuro-2a細胞，k-bm1代表kp-n-rt-bm-1細胞

100、圖2顯示了根據本發明的一個實施方式，檢查在三步克隆選擇過程中確認snap25的裂解程度的western印跡分析的結果。在第二次克隆選擇過程(第二次克隆選擇)中，僅從包括克隆42在內的6個克隆中,選擇了顯示由bont/a引起的snap25顯著裂解的克隆42，在第三次克隆選擇過程(第三次克隆選擇)中，克隆24(42f)在多個相同的實驗中始終顯示bont/a對snap25的裂解。

101、圖3是示出根據本發明一個實施方式,測量n2-42f細胞與其親本neruo-2a細胞之間的分裂時間(倍增時間)的結果圖。

102、圖4顯示了使用leica?dmi8成像的neruo-2a(親本細胞系)、sima細胞和克隆n2-42f的20x圖像，當達到60％的匯合時，根據本發明的一個實施方式來確認細胞的形態。

103、圖5顯示了根據本發明的一個實施方式，在涂有iv型膠原蛋白，明膠和聚-d-賴氨酸中的各平板中培養的n2-42f的圖像。

104、圖6a和圖6b示出了根據本發明的一個實施方式的western印跡分析結果，用于檢測用不同濃度的bont/a處理sima細胞和n2-42f時出現snap25的裂解程度，和用不同類型的肉毒桿菌毒素處理n2-42f和neuro-2a時出現的sanp25或vamp2裂解程度。

105、圖7a和7b示出了根據本發明的一個實施方式，通過本發明克隆選擇過程獲得的n2-42f，確定其菌株穩定性的western印跡分析結果。

106、圖8是顯示用于根據本發明的一個實施方案使用合成多肽生產單克隆或多克隆抗體的snap25抗原多肽位置的示意圖。

107、圖9是顯示用于形成用于產生單克隆抗體的雜交瘤細胞的方法的示意圖，以及根據本發明的一個實施方式的篩選克隆的方法。

108、圖10a至10c示出了根據本發明的一個實施方式，使用elisa初始篩選雜交瘤細胞以產生的單克隆抗體的結果。

109、圖11a至11c示出了根據本發明的一個實施方式，從初始雜交瘤細胞篩選結果中重新篩選用于單細胞克隆產生的細胞的結果。

110、圖12a至12c示出了根據本發明的一個實施方式，用于產生單細胞克隆的第二重選的結果。

111、圖13a至13c示出了根據本發明的一個實施方式，用于產生單細胞克隆的第三重選的結果。

112、圖14a和14b示出了根據本發明的一個實施方式，從兔血清蛋白分離的用于產生多克隆抗體的igg的模式。

113、圖15a和15b示出了根據本發明的一個實施方式，本發明中制備的單克隆抗體的動力學分析的結果。

114、圖16a和16b顯示了根據本發明的一個實施方式，單克隆抗體的動力學分析的結果，該單克隆抗體在本發明中產生并且與經逐步稀釋的重組gst-snap25結合/解離。

115、圖17顯示了根據本發明的一個實施方式，對本發明產生的單克隆抗體的抗原結合特異性進行western印跡分析的結果。

116、圖18a和18b顯示了根據本發明的一個實施方式進行的western印跡分析的結果，以確認在本發明中產生并與hrp綴合的單克隆抗體的抗原結合特異性。

117、圖19a至19c示出了根據本發明的一個實施方式，本發明中產生并與生物素綴合的單克隆抗體的sds-page電泳的結果。

118、圖20a和20b示出了根據本發明的一個實施方式，根據本發明中制備并與ap交聯的多克隆抗體的sds-page電泳結果。

119、圖21a至21c示出了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法優化毒素時間的結果。

120、圖22顯示了根據本發明的一個實施方式，確定肉毒桿菌毒素的活性的方法中優化毒素培養基的結果。

121、圖23a和23b示出了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法中優化敏化劑的結果。

122、圖24a至24c示出了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法優化gt1b的結果。

123、圖25a和25b示出了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法中優化n2/b27的結果。

124、圖26a和26b示出了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法中優化捕獲抗體處理的結果。

125、圖27a和27b示出了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法中優化檢測抗體處理的結果。

126、圖28顯示了根據本發明的一個實施方式，在確定肉毒桿菌毒素的活性的方法中優化檢測hrp綴合物活性方法的結果。

127、圖29是表示根據本發明的一個實施方式，用于確定肉毒桿菌毒素的活性的夾心elisa方法的示意圖。

128、圖30a至30c示出了根據本發明的一個實施方式，檢測用于確定肉毒桿菌毒素的活性的夾心酶聯免疫分析方法的準確度和線性的結果。

129、圖31a至31c顯示了根據本發明的一個實施方式，通過夾心elisa測量用于測定肉毒桿菌毒素的活性的生物效力的結果。

130、【本發明的最佳實施方式】

131、本發明旨在克服常規cpba的局限性，并開發更有效的cbpa。通過本發明的cpba，對13種不同的神經元細胞系進行了比較分析，并開發了在構成神經元細胞的廣泛克隆中最優化的新克隆n2-42f。該克隆的分裂時間相比sima小于24小時，并且可以附著在涂有聚-d-賴氨酸(pdl)的培養皿中并在其中穩定培養。本發明中的抗體是一種對snap25具有顯著高結合親和力和特異性的單克隆抗體。此外，本發明涉及使用n2-42f細胞和對snap25具有顯著高的結合親和力和特異性的單克隆抗體的基于細胞的最佳cbpa測定法，并且該cbpa可以測量0.5u或以下的肉毒桿菌毒素的滴度。

132、【本發明的實施方式】

133、在下文中，將通過實施例進一步詳細描述本發明。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些實施例僅用于更詳細的說明本發明，并且不旨在限制本發明的范圍。

134、實施例

135、制備實施例1：細胞制備材料的準備

136、本發明中用于細胞生產的材料如下所述。

137、0.25％胰蛋白酶edta(gibcotm25200056)，glutamaxtm(gibcotm35050061)，mem(gibcotm11095080)，mem非必需氨基酸(1xneaa；gibcotm?11140050)，丙酮酸鈉(gibcotm11360070)，trypletm表達酶(1x)(gibcotm12604021)，抗生素抗霉菌溶液(aa；100x；sigma?a5955)，硼酸(sigma?b6768)，來自人胎盤中的膠原蛋白(sigma?c533)，二硫蘇糖醇(dtt；sigma?d0632)，dmso(sigma?d2650)，明膠溶液(sigma?g1393)，聚-d-賴氨酸氫溴酸鹽(sigma?p6407)，聚山梨醇酯(sigma?p7949)，四硼酸鈉(sigma?221732)，dpbs(welgenelb001-02)，胎牛血清(fbs；yi?frontier?us-fbs-500)，甘油(affymatrix?usb?16374)，pcr支原體檢測儀(takara?bio?6601)，ripa緩沖液(10x；abcam?ab156034)，6孔板(falcon353046)，12孔板(corning?cls3513),24孔板(falcon?353047),t75燒瓶(falconbd353136),和takara?ex?taqtm(takara?bio?rr001)。

138、制備實施例2.肉毒桿菌毒素a(肉毒桿菌毒素血清型a；bont/a)原液，稀釋液和bont/a毒素培養基的制備

139、肉毒桿菌毒素a(肉毒桿菌毒素血清型a；bont/a，以下簡稱bont/a)由hugel(exbii1501)提供。

140、制備實施例2-1.bont/a原液和毒素培養基的制備

141、使用毒素稀釋緩沖液(含有50mm磷酸鈉，ph7.0，1mm二硫蘇糖醇(dtt)，0.05％聚山梨醇酯，20％甘油，和0.2mg/ml乙酰化-bsa)稀釋bont/a，以制備原液(10nm)。bont/a原液在-80℃下等分儲存，直到用于以下實施例。通過將凍干的bont/a(200u)在1ml毒性培養基或生理鹽水中重新懸浮并使懸浮液在室溫下靜置10分鐘來制備母液。儲備液a通過在室溫下將150μl母液與450μl的毒素培養基混合來制備。儲備液b通過在室溫下將20μl儲備液a與180μl毒素培養基混合來制備。儲備液c通過在室溫下將20μl儲備液b與180μl毒素培養基混合來制備。

142、制備實施例2-2.用于導出標準曲線的標準參考樣品的制備

143、標準儲備液a(50pm,113.6u/ml)通過將凍干的bont/a(100u)在880μl毒素培養基或生理鹽水中重懸并使懸浮液在室溫下靜置10分鐘來制備。通過在室溫下將50μl標準儲備液a與200μl毒素培養基混合制備標準儲備液b(10pm，22.7u/ml)。通過在室溫下將50μl標準儲備液b與200μl毒素培養基混合制備標準儲備液c(2pm，4.54u/ml)。

144、制備實施例3.用于神經元細胞培養的平板包被

145、用明膠溶液(1x?pbs中含有0.1％)、vi型膠原蛋白(0.1mg/ml)或聚d-賴氨酸(pdl)(50μg/ml)包被培養板三小時或過夜。培養板用15ml?1x?dpbs沖洗兩次，并在組織培養罩中風干。

146、用于板涂層的膠原在去離子水中重構至最終濃度為0.1mg/ml。通過將5mg粉末溶解在0.1m硼酸鹽緩沖液(ph?8.5)中制備聚-d-賴氨酸，因此可用于涂層。

147、制備實施例4.神經元細胞和培養基

148、為了篩選對bont/a具有高敏感性的神經元，如下表1所示，從5個器官獲得13個神經元，以下13個神經元在含有所述機構推薦成分的培養基中維持和繁殖。

149、對于從neuro-2a細胞中克隆選擇的n2-42f細胞每4次傳代，或對sima細胞每10次傳代，使用pcr支原體檢測試劑盒(寶生物工程株式會社6601)監測支原體污染。根據制造商推薦的程序進行pcr試驗。簡而言之，收集細胞培養上清液并孵育3或4天。使用3μl培養上清液和50μl包含1x?pcr緩沖液、dntp混合物、mcgp?f1/r2引物和takara?ex?taqtm(takara?biorr001)的混合溶液進行pcr(50μl)。然后，取10μl各pcr產物于1％瓊脂糖凝膠上電泳，然后用乙錠染色觀察，從而確認是否會發生支原體污染。

150、表1

151、

152、

153、制備實施例5：抗體制備材料的準備

154、用于本發明的抗體制備的材料如下所述。

155、2-巰基乙醇(sigma?m3148)，4-碘苯硼酸(sigma?471933)，10x?tbs(bio-rad?170-6435)，10x?tris/甘氨酸/sds緩沖液(bio-rad?161-0772)，12％mini-tgxtm(bio-rad?456-1046)，乙酸(merck?100063)，堿性磷酸酶(sigma?p0114)，amicon?ultra-15，ultracel?30k(millipore?ufc903024)，100x抗生素抗真菌溶液(aa)(sigma?a5955)，溴酚藍(sigma?b0126)，dmem(gibcotm?11995065)，dmso(sigma?d2650)，dmso(sigma472301)，ez-link?nhs-peg4-生物素(賽默飛世爾21329)，乙二醇(sigma?324558)胎牛血清(fbs；yi?frontier?us-fbs-500)，甘油(affymetrix?usb?16374)，甘氨酸(bioshopgln001)，戊二醛溶液(sigma?g7651)，辣根過氧化物酶(hrp；sigma?p6782)，過氧化氫溶液(sigma?216763)，魯米諾(sigma123072)，氯化鎂(sigma?m8266)，100x?mem非必需氨基酸(gibcotm?11140050)，甲醇(merck?106009)，strip?tube(axygen?pcr-0208-cp-c)，聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(millipore?iseq00010)，氯化鉀(sigma?p9333)，precision?plusproteintm雙色標準液(bio-rad?1610374)sds溶液20％(w/v)(bio-rad?161-0418)，脫脂牛奶(bd?difcotm?232-100)，乙酸鈉(sigma?w302406)，碳酸氫鈉(sigma?s6014)，硼氫化鈉(sigma?452882)，氯化鈉(merck?106404)，高碘酸鈉(偏高碘酸鈉)(sigma?s1878)，磷酸二氫鈉(sigma?s5011)，磷酸氫二鈉(sigma?s7907)，三水合錫酸鈉(sigma?336262)，四丁基硼氫化銨(sigma，230170)，t175(spl?74175)，t75燒瓶(spl?70375)，tris(bioshop?trs001)，以及氯化鋅(sigma?229997)

156、制備實施例6：抗體生產方法的設置

157、制備實施例6-1.使用合成肽產生多克隆和單克隆抗體

158、如圖8所示，在c-或n-末端綴合鑰孔戚血藍素(khl,keyhole?limpet?hemocyanin)綴合合成肽。為此，先用多肽抗原免疫家兔，制備多克隆血清。初始注射后，定期向兔子給藥6周。采用western印跡分析和elisa檢測兔血清的反應性和特異性。在使用前，將它們儲存在-80℃。其次，對4只小鼠注射肽抗原制備單克隆抗體。然后收集產生抗體的脾細胞，并與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤，然后進行三輪單細胞克隆選擇，如圖9所示。簡而言之，首先使用肽抗原通過elisa篩選雜交瘤，然后使用重組snap25蛋白(gst-snap25fl和gst-snap25197)或源自神經元細胞(sima)的總細胞裂解物進行western印跡分析，最后通過夾心elisa篩選總細胞裂解物。如下所述，擴增產生抗體的雜交瘤并將其儲存在液氮的氣相中，直到將其回收用于抗體生產為止。

159、制備實施例6-2.snap25-親和柱的制備

160、重組snap25197使用amicon?ultra-15通過在4℃下以1,000×g重復離心10分鐘濃縮至10mg/ml，同時使用納米分光光度計(drawell?scientific儀器有限公司，上海)測量蛋白濃度。在amico?ultra-15中，將等分試樣(3ml)的snap25197與12ml偶聯緩沖液(0.1mhepes，ph?7.5，0.1m?nacl)混合，并以1,000x?g離心的方式濃縮。重復此緩沖液交換6次，然后將sanp25197濃縮液添加到1ml去離子水中的affi-gel?15(bio-rad)漿液中。室溫下，在振蕩器培養箱上孵育1小時后，在4℃下，affi-gel?15以1,000×g離心10分鐘。將snap25197-綴合的affi-gel?15(snap25-affigel)重新懸浮在10ml的10mm乙醇胺鹽酸鹽中，在ph8.0下，室溫孵育1小時。用1x?pbs洗滌后，使用前將snap25-affigel儲存在含有0.2％疊氮化鈉的1×pbs中。

161、制備實施例6-3.純化多克隆抗體

162、兔血清用10mm?tris-hcl，ph7.5稀釋10倍，并在4℃下以10,000×g離心10分鐘。在通過0.45μm微孔濾器(nalgenetm)過濾后，將透明血清稀釋液通過snap25-affigel三次。然后用20cv的10mm?tris-hcl，ph?7.5和0.5m?nacl洗滌snap25-affgel，用12cv的0.1m乙酸鈉，ph5.5，0.1m甘氨酸，ph?4.0，0.1m甘氨酸，ph?2.5和0.1m三乙胺，ph?11.5依次洗脫結合的蛋白。在洗脫期間，在含有0.1ml的1m?tris-hcl，ph8.0的管中收集蛋白樣品。將含蛋白的峰組分合并并使用amiconultra-15濃縮至1ml。每隔90分鐘用四次1x?pbs和10％甘油(0.5l)的透析液透析后，通過sds-page和elisa進行分析。

163、制備實施例6-4.抗體與辣根過氧化物酶(hrp)綴合

164、對于hrp的綴合，使用amicon?ultra-15將純化的b4或c16?igg濃縮至10mg/ml，在4℃下以1,000xg的速度重復離心約15分鐘，同時每次離心結束時提供過量的綴合緩沖液(0.1m?nahco3,ph?9.5,0.9％?nacl)。將hrp(5mg)溶解在1.2ml去離子水中，并與0.3ml0.1m高碘酸鈉在10mm磷酸鈉(ph?7.0)中的溶液混合。在室溫下孵育20分鐘后，在4℃下，將hrp溶液用1mm乙酸鈉，ph?4.0，透析四次，進行6小時。將濃縮的抗體(5mg)和活化的hrp(5mg)在微量離心管中混合在一起，并在避光條件下于室溫孵育2小時。通過添加0.1ml硼氫化鈉(去離子水中為4mg/ml)來終止輟合反應。使用pur-a-lyzer?maxi?50000透析hrp抗體綴合物，在4℃下，每小時一次，進行3次1×pbs透析，一次1×pbs/50％甘油透析。在使用前，hrp抗體輟合物儲存在4℃或-80℃下以便長期保存。

165、制備實施例6-5.抗體綴合活性生物素

166、將a15?igg(1mg/ml)轉移到pur-a-lyzer?maxi?20000中，并在4℃的條件下，每隔1小時，用含有0.1m磷酸鹽，ph?7.2和0.15m?nacl的反應緩沖液進行四次透析。將活化的生物素(在反應緩沖液中10mm)(ez-link?nhs-peg4-生物素)與50μg等分試樣的a15?igg混合至終濃度為0.1mm，0.25mm或0.5mm。用反應緩沖液將混合物調節至100μl，并在避光條件下于4℃溫育2小時。加入2μl0.1?m甘氨酸后，將反應混合物分別在4℃的條件下，每小時1次，用pbs透析3次，用1xpbs/50％甘油透析1次，并在-20℃下儲存在微量離心管中。使用piercebiotin定量試劑盒(賽默飛科技28005)評估igg的生物素化程度，并通過夾心elisa測定生物素化igg的反應性和特異性。

167、制備實施例6-6.ap和抗體的交聯

168、通過將戊二醛添加至0.25％(20μl)的混合物中，所述混合物包含反應緩沖液(0.1m磷酸鈉，ph?6.8)，50μg?ap(2.2mg/ml)(sigma-aldrich?p0114-10ku)和100μg純化的igg，例如單克隆抗體a15，多克隆抗體ra15?igg和多克隆抗snap25?igg(sigma-aldrichs9684)，開始堿性磷酸酶(ap)與抗體的輟合。在冰上在避光條件下孵育1小時后，向反應液中加入1升等分試樣的1m乙醇胺，并在避光條件下于室溫孵育1小時。在4℃的條件下，每隔1小時，ap-igg偶聯物用1x?pbs透析3次，并用存儲緩沖液(25mm?tris-hcl，ph?7.5，1mmmgcl2、0.1mm?zncl2和50％甘油)透析一次。通過如下所述的直接elisa分析ap-igg綴合物的抗原結合特異性和ap活性。

169、制備實施例6-7.octet?red96測量kd

170、為了進行單克隆抗體的動力學分析，按照制造商建議的步驟，在30℃下使用octet?red96儀器進行生物層干涉(bli)測定。簡而言之，將重組gst-snap25fl或snap25197在1x動力學緩沖液(1x?kb)/1x?pbs中稀釋至125或250nm，然后將分析物(即純化的igg)在1x動力學緩沖液中依次稀釋至3.9、7.8、15.6、31.25、62.5，為125、250nm。在1x動力學緩沖液中平衡1分鐘后，用抗gst探針(fortébio18-5096)裝載gst-sanp25fl或gst-snap2519730分鐘，然后將其浸入1x動力學緩沖液中10分鐘。在分析物結合和解離各10min之后，獲得動力學曲線，并使用octet分析軟件估算kd(平衡解離常數)。

171、作為替代動力學分析，抗小鼠igg?fc捕獲(amc)生物傳感器負載抗體，并與連續稀釋的gst-snap25進行結合/解離。簡而言之，將純化的igg稀釋至100或200nm，而gst-snap25fl或snap25197連續稀釋至1.56,3.125,6.25,12.5,25,50和100nm。在1x動力學緩沖液中平衡1分鐘后，將amc生物傳感器裝載igg?10min，然后將其浸入1x動力學緩沖液中10min。分析物的結合和解離各進行10min，并如上所述估算kd。

172、制備實施例6-8.直接elisa分析

173、用1μg?gst-snap25fl或gst-snap25197在ph?9.5的0.1m的碳酸鹽緩沖液中于37℃包被免疫板(賽默飛世爾科技a71125)2小時。用1x?pbs洗滌后，將免疫板與300μl封閉緩沖液(1x?pbs中的5％脫脂奶粉)在室溫下孵育15分鐘。用1x?pbst(1x?pbs/0.05％吐溫-20)洗滌3次后，向微孔板中加入100μl雜交瘤細胞培養上清液(1:20～10000稀釋)或腹水(1:1000～312500稀釋)并在室溫下孵育1小時。用1x?pbst將微孔板洗滌3次，向其中加入山羊抗小鼠igg-hrp偶聯物(1：1000稀釋)(ab?frontier?lf-sa8001)的等分試樣(每孔100μl)。在室溫下孵育1小時后，將微孔板用1x?pbst洗滌3次，并用50μl?1-steptmultra?tmb-elisa(賽默飛世爾34028)在室溫下進行hrp反應3-25分鐘。通過添加50μl?1m?h2so4終止hrp反應，并使用bio-tek?synergyneo2在450nm處估計elisa信號。

174、制備實施例6-9.western印跡分析

175、重組gst-snap25(每孔20ng～1μg)或neuro-2a細胞的總細胞裂解液(每孔15μg)與精確蛋白標準品(每孔3μl)進行10％或12％sds-page分離。在含有48mm?tris，38.9mm甘氨酸，20％甲醇，0.05％sds的轉移緩沖液中浸泡5分鐘后，使用trans-semi-dry(bio-rad?170-3940)將蛋白轉移至pvdf膜上，在25v下45分鐘。將pvdf膜用1x?tbst(1x?tbs/0.05％tween?20)短暫漂洗，然后與封閉緩沖液(1x?tbst中的5％脫脂奶粉)在室溫下孵育15分鐘。隨后，將pvdf膜與任一雜交瘤培養上清液(在封閉溶液中以1：100稀釋)在室溫下孵育45分鐘。將多克隆抗snap25?igg(sigma?s9684)(1：8,000稀釋)和抗snap25197?igg(r&dmc6050)(1：100稀釋)用作陽性對照。用1x?tbst洗滌3次后15分鐘，然后將pvdf膜與山羊抗兔igg-hrp輟合物(1:10000稀釋度)或山羊抗小鼠igg-hrp輟合物(1:10000稀釋度)于室溫下孵育45分鐘。用1x?tbst洗滌3次后，檢測重組gst-snap25或內源性snap25，并使用ecl溶液(見下文)和bio-rad?chemidoctm?mp成像系統(bio-rad?universal?hood?iii)進行定量。

176、使用前將溶液a和溶液b按1:1的比例混合制備ecl工作溶液。溶液a包含0.1mtris-hcl(ph?8.8)、dmso中的2.5mm魯米諾(luminol)、4mm?4-碘苯基硼酸、0.2mm四丁基硼氫化銨、2％乙二醇和0.02％?triton?x-100組成，溶液b包含0.1m?tris-hcl(ph?8.8)、10.6mm過氧化氫和0.012％酒石酸鈉。

177、實施例1：篩選對bont/a敏感的神經元

178、實施例1-1.根據bont/a對snap25蛋白的切割篩選bont/a敏感神經元

179、神經元細胞以2x?105個細胞/孔的密度接種在24孔板中。將細胞培養24小時，然后用2nm?bont/a處理細胞培養基，然后培養3天。此處使用了適用于上述每種類型細胞的培養基。通過使用1x?ripa緩沖液(abcam,ab156034)裂解細胞獲得全細胞裂解物。然后，將3.5μg蛋白質加入12％?sds-page并進行電泳。電泳完成后，將sds-page浸入由48mm?tris、38.9mm甘氨酸、20％甲醇和0.05％?sds組成的轉移緩沖液中5分鐘，然后使用trans-semi-dry(bio-rad170-3940)將sds-page上的蛋白質轉移到pvdf膜。用1x?tbst(1x?tbs/0.05％tween?20)沖洗pvdf膜后，將膜置于封閉緩沖液(1x?tbst中的5％脫脂奶粉)中，并在室溫下孵育15分鐘。

180、然后，將膜與在封閉緩沖液中以1:8000稀釋的snap25fl(多克隆抗snap25igg(sigma，s9684))抗體和在封閉緩沖液中以1:100稀釋的snap25197(抗snap25197?igg(r&d，mc6050))抗體一起,在室溫下孵育45分鐘。隨后，將pvdf膜用1x?tbst洗滌3次，每次15分鐘，并在室溫下用含有hrp偶聯igg的稀釋劑孵育45分鐘。pvdf膜使用1x?tbst洗滌3次，并使用ecl溶液和chemidoctmmp成像系統(bio-rad)成像和定量。ecl溶液由本發明人配制優化，使用前通過將sola和solb按1:1混合得到。在此，構成ecl溶液的sola和solb溶液的具體組成如下表2所示，根據snap25的裂解程度測定對bont/a的敏感性，結果如下表3所示。

181、表2

182、

183、表3

184、 細胞 對bont/a(2nm)的敏感性 sk-n-sh 無 sh-sy5y 無 imr-32 無 neuro-2a 有 sk-n-mc 無 n1e-115 無 ng108-15 無 be(2)-m17 無 sima 有 kp-n-rt-bm-1 有 kp-n-yn 無 nh-6 無 nh-12 無 tgw 無

185、如表3所示，除了sima細胞外，已知13種神經細胞中其對bont/a敏感，只有neuro-2a和kp-n-rt-bm1(k-bm1)細胞產生可檢測水平的snap25蛋白的裂解。

186、實施例1-2.篩選bont/a敏感細胞

187、在與材料和方法相同的條件下，將neuro-2a，sima和kp-n-rt-bm-1細胞分別在24孔板上培養，并通過western印跡分析snap25蛋白的裂解現象。結果如圖1所示。

188、對于neuro-2a，sima和k-bm1細胞，估計snap25裂解的程度分別約為33％，66％和29％。

189、由于以下原因，neuro-2a進一步通過k-bm1進行克隆選擇。首先，bont/a的體內效力，通常通過小鼠致死率(即小鼠ld50)來衡量，可以用小鼠細胞系更好地概述。事實上，neuro-2a是小鼠細胞系，而k-bm1是人細胞系。其次，k-bm1的生長速度比neuro-2a慢得多。應當指出，據報道，人類神經母細胞瘤細胞系sima細胞的群體倍增時間為34至100小時(dsmz?acc-164)。第三，在顯微鏡下，neuro-2a細胞似乎是幾種細胞類型的混合群體。因此，已確定在異質neruo-2a細胞群中可能存在對bont/a高度敏感的細胞。

190、實施例2：篩選bont/a敏感的克隆

191、進行了在實施例1中選擇的neuro-2a細胞群體中，選擇對bont/a高度敏感的克隆的方法。

192、實施例2-1.neuro-2a細胞的克隆培養

193、neuro-2a細胞在補充有10％胎牛血清(fbs)，1x非必需氨基酸(1x?neaa)，1x丙酮酸鈉，1x?glutamaxtm和1x抗生素抗霉菌劑(1x?aa)的mem中培養。

194、當細胞匯合度達到約80-90％時，用1x?tryple(gibcotm?12604021)處理制成單細胞懸液。用血球計數儀和臺盼藍測定活細胞數后，將細胞稀釋至每ml培養基10個細胞的密度。然后，在96孔培養板上加入100μl的稀釋的單細胞懸液。用顯微鏡定期觀察菌落生長情況。在單細胞達到60％的密度時，將單細胞按上述方法轉移到24孔板上。之后，將它們平均分成兩半，一半儲存在液氮罐中，另一半測試對bont/a毒素的敏感性。

195、總共672個細胞克隆從24孔板傳代培養到7x96孔微孔板，用于細胞克隆的bont/a毒素測定。第二天，用補充有2mm?l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，1x?b27，1x?n2，1x?neaa(分化培養基)的prmi1640代替培養基，以誘導神經元分化。在誘導神經分化的第4天，將gt1b(在1x非毒素培養基中稀釋)添加至終濃度為25μg/ml的分化培養基中，培養24小時。其后，用含有bont/a(0.1nm)的毒素培養基代替培養基，并將細胞再孵育2天。以與實施例1中所述相同的方式進行蛋白質印跡分析以確認snap25的切割程度，并進行初級克隆選擇過程。該克隆選擇過程重復3次，在每個克隆選擇過程中確認的結果如圖2所示。。

196、按照allergan為sima細胞優化的克隆選擇程序并稍作修改，測試了142個克隆對bont/a的敏感性。結果如圖2所示，共鑒定出19個陽性克隆，這些克隆對bont/a的敏感性明顯高于親本neuro-2a。在經過多輪單細胞克隆選擇的陽性克隆中，只有克隆42持續表現出比親本neuro-2a更高的bont/a敏感性。根據rust和pollok，2011年和sarntivijai等人，2008年推薦的命名法，通過該步驟最終選擇的克隆42被命名為“n2-42f”。

197、實施例2-2.冷凍細胞的回收、增殖和儲存

198、冷凍細胞的回收如下。

199、從液氮冰箱中取出的低溫儲存瓶在37℃水浴中輕輕攪拌，在2分鐘內迅速解凍。通過噴灑70％乙醇來凈化細胞儲液瓶。在層流組織培養罩中擰下小瓶的頂部。然后，將小瓶的內容物轉移到含有9ml預熱完全培養基的無菌15ml錐形管中。將15ml試管輕輕離心(125x?g(重力)10分鐘后，吸去上清液，并將細胞加入2ml完全培養基中。通過輕輕移液使沉淀松散而重新懸浮細胞。然后，將細胞懸浮液轉移到含有25ml完全培養基的t75燒瓶中并根據制備實施例中所述的方法包被。細胞懸液在co2培養箱中于37℃培養。

200、細胞培養如下進行。

201、當在燒瓶中培養的細胞達到約90％的密度時，吸去培養基，并用1x?dpbs沖洗燒瓶內部一次。將1ml?0.25％胰蛋白酶-edta添加到細胞中，然后在37℃下培養5分鐘。然后，將9ml完全培養基添加到細胞沉淀中，然后通過重復移液將其破碎成單個細胞。將單細胞懸液轉移到15ml錐形管中，并以800x?g(重力)離心5分鐘。然后，完全吸除上清液。然后，將10ml完全培養基加入燒瓶中，并將細胞沉淀重新懸浮在其中。使用血細胞計數器測定細胞的活力。然后，將3ml細胞懸浮液轉移到新的t75燒瓶中。然后，將細胞培養3天至約90％的密度。

202、用于細胞庫建立的細胞凍存如下進行。

203、細胞在2到8個t75燒瓶中培養，達到約90％的密度。當細胞達到生長后期(約2.0x107個細胞/燒瓶)時，吸除培養基，并以與細胞培養程序相同的方式將細胞胰蛋白酶消化成單細胞并離心。然后，使用冷凍培養基以5x106個細胞/ml的密度重新懸浮細胞沉淀。將1ml細胞懸浮液轉移到低溫儲存小瓶中，然后將其轉移到充滿異丙醇的凍存容器中。凍存容器在-80℃下儲存過夜。第二天，僅取出低溫儲存小瓶并儲存在液氮冷凍機中。

204、實施例3：n2-42f特征的鑒定和培養環境

205、實施例3-1.確認倍增時間

206、neuro-2a細胞和n2-42f的分裂時間證實了snap25蛋白的切割形式是可檢測的。將每個細胞和克隆以每孔1.5×105個細胞的數量等分于6孔板中，每天通過血細胞計數器和臺盼藍染色計數活細胞總數，持續6天。。使用以下方程式(表4)，使用在指數生長期獲得的活細胞數來計算分裂時間。結果如表5和圖3所示。在下表4的公式中，t是孵育時間，xe和xb分別是培養時間的開始和結束時的細胞數。

207、表4

208、 分裂(倍增)時間＝＝tⅹln2/ln(xe/xb)

209、表5111

210、 細胞 分裂(倍增)時間(小時) neuro-2a 24±4.7 n2-42f 24±2.9

211、如表5和圖3所示,對于neuro-2a，分裂時間為24±4.7小時，對于n2-42f為24±2.9小時，因此沒有表現出顯著差異。

212、實施例3-2.n2-42f形態學的確認

213、allergan報告從sima細胞中分離出的bont/a敏感型克隆(h1)作為親本細胞(fernandez-salas等,2012)。基于此報告，期望sima細胞也像neuro-2a一樣代表混合細胞類型的異質細胞群體，但是它們的亞克隆(例如h1和n2-42f)被預期是同質細胞類型。因此，為了確認n2-42f是相同的細胞類型，在顯微鏡下檢查親本細胞neuro-2a、n2-42f和sima細胞，結果如圖4所示。

214、如圖4所示，在顯微鏡下，被認為是混合細胞類型的neuro-2a和sima細胞均表現出異質形態，但n2-42f表現出非常均勻的形態。

215、從以上結果可以看出，n2-42f對應于同質細胞類型，作為構成neuro-2a的多種克隆中的單個克隆。

216、實施例3-3.確認培養環境

217、為了確認為bont/a毒性實驗優化的n2-42f的培養環境，n2-42f細胞分別在涂有iv型膠原蛋白、凝膠和聚d-賴氨酸的培養板中培養，培養形式通過顯微鏡測量，結果如圖5所示。

218、如圖5所示，已證實親代neuro-2a細胞在未涂覆的平板中能夠順利增殖，而n2-42f細胞在涂有聚-d-賴氨酸的平板上能夠順利增殖。此外，未包被板(無)和用iv型膠原蛋白(膠原蛋白iv)或明膠包被的板均不支持n2-42f細胞的有效生長。在那些未涂有聚-d-賴氨酸的平板上，n2-42f看起來不健康，它們松散地附著在平板上。相比之下，已證實，在聚-l-賴氨酸涂層平板上，n2-42f細胞牢固附著且分布均勻。

219、從以上結果可以看出，本發明的n2-42f在涂有聚-d-賴氨酸的平板上具有優化的培養環境。因此，在本發明中，聚-d-賴氨酸包被的培養板用于測量n2-42f細胞的bont/a毒性。

220、實施例4：確認n2-42f對肉毒桿菌神經毒素的敏感性

221、sima細胞作為對照。將含有不同濃度bont/a的1x毒素培養基添加到培養n2-42f細胞的96孔板中，并用聚-d-賴氨酸包被，加入n2-42f的bont/a，并測量敏感性。

222、具體而言，在上述條件下將n2-42f培養4天后，用50μl?1x?sds樣品緩沖液處理n2-42f細胞。然后對細胞進行western印跡分析，結果如圖6a所示。該實驗重復三次。

223、如圖6a所示，證實0.93pm或更少的bont/a對內源性snap25的切割在sima細胞和n2-42f中都不顯著。在用2.78至25pm的bont/a處理后，snap25的裂解程度被證實在n2-42f中為25至75％，在sima細胞中為33至75％。

224、從以上結果可以看出，本發明的n2-42f對bont/a的敏感性與sima細胞一樣。

225、包括bont/a，共有從bont/a到bont/g的7種血清型不同的肉毒桿菌神經毒素。與bont/a類似，bont/b也已獲得藥品應用的許可，例如或因此，探討了n2-42f細胞是否可用于任何基于細胞的對不同的肉毒桿菌神經毒素血清型的效能分析。為此目的，比較分化的n2-42f和neuro-2a細胞對不同神經毒素復合物的敏感性(metaboologics?co?8188～ra194)。

226、如圖6b所示，25pm的metabiologics?bont/a(m-bont/a)使n2-42f中的snap25裂解達到飽和程度。在相同條件下，在neuro-2a細胞中觀察到約44％的snap25裂解。n2-42f細胞對m-bont/a的更高敏感性與其對hugel(即botulax)制備的bont/a敏感性相一致。n2-42f細胞還表現出對m-bont/b的顯著較高的敏感性。用2nm的m-bont/b中毒會導致n2-42f細胞中的vamp2接近完全裂解，而neuro-2a中只有約50％的裂解。盡管程度較小，但n2-42f細胞對m-bont/c和m-bont/f的敏感性較高。但是，對于m-bont/d(5pm或200pm)，n2-42f和neuro-2a細胞之間的敏感性沒有明顯差異(數據未顯示)。他們也沒有顯示出對m-bont/e(10～400pm)或bont/g(50～2000pm)的任何可檢測水平的敏感性。我們的結果表明，n2-42f細胞可以用作基于細胞的bont/a，bont/b，bont/c和bont/f效能分析的宿主。

227、實施例5：n2-42f的譜系穩定性的確認

228、神經元的譜系穩定性是利用細胞為基礎的檢測平臺的一個非常重要的因素。據此，確認了n2-42f的譜系穩定性。

229、n2-42f細胞連續培養以多次傳代。用早期傳代的n2-42f細胞制備主細胞庫。每傳代5次，將細胞也保存在液氮凍存箱中，以保持克隆的穩定性。簡而言之，將第5代(p5)和第15代(p15)儲存的n2-42f細胞解凍，當n2-42f細胞達到約90％的密度時，根據在實施例4中描述的方法檢測其對bont/a的敏感性。結果如圖7所示。

230、使用sima細胞作為對照，重復該實驗三次。

231、如圖7所示，第5代n2-42f(n2-42f(p5))中由bont/a引起的snap25裂解為63％(泳道6)、66％(泳道7)和68％(泳道8)，在第15代的n2-42f(n2-42f(p15))中為63％(泳道6)、73％(泳道7)和71％(泳道8)。

232、這些結果表明，與allergan構建的sima細胞的h1克隆相似，從親本neuro-2a獲得的n2-42f對bont/a的敏感性不僅在第5代保持，而且在第15代保持。因此，可以看出n2-42f是僅次于sima細胞的h1克隆的高效細胞檢測平臺的克隆。

233、實施例6：基于n2-42f的活性測定的實驗步驟

234、實施例6-1.實驗方法

235、以上述制備實施例中描述的方式包被96孔板。在風干96孔培養板的同時，以5.5x105細胞/ml的密度制備總共7ml的n2-42f細胞懸液。使用從t75燒瓶中獲得的90％的密度的n2-42f細胞。將細胞懸液轉移到無菌緩沖液儲器中，并使用多通道移液器將細胞懸液的等分試樣(100μl)分配到每個孔中，并在co2培養箱中孵育96孔培養板。在96孔板的外孔中應裝滿1x?aa溶液(1x無菌ddh?2o中的抗生素抗真菌溶液)的等分試樣(100μl)，以避免嚴重的邊緣效應。

236、分配細胞后的第二天，使用多通道移液器將所有細胞培養基從96孔板上移出，然后加入100μlrpmi?1640進行漂洗。然后將bont/a毒性培養基處理到每個96孔板上，并在37℃，5％co2下孵育4天。另外，制備了7ml量的捕獲抗體b4?igg，然后在elisa平板中將其分成50μl，并在4℃下保存過夜。

237、為了進行測量，使用多通道移液器從96孔板中去除bont/a毒性培養基，并用60μl裂解緩沖液(ph?7.5、20mm?hepes，1％triton-200mm?nacl，1mm?egta和5mm?edta，在使用前立即添加蛋白水解抑制劑)處理每個孔并以500rpm的速度在4℃下孵育20分鐘。之后，獲得每個孔中包含的溶解緩沖液，并在4℃下以4000rpm離心20分鐘。

238、將elisa板用洗滌緩沖液洗滌3次，向每個孔中加入300μl封閉緩沖液的等分試樣，在室溫下孵育15分鐘，并在去除封閉緩沖液后用洗滌緩沖液洗滌兩次。

239、將50μl?tcl等分試樣從96孔培養板轉移到包被有捕獲抗體(b4)的elisa板中，并將elisa板在微板振蕩器上以200rpm在4℃孵育4小時。最后，用洗滌緩沖液洗滌3次。

240、對于snap25197的檢測，將檢測抗體加入elisa板(每個孔50μl)中，將板在熱搖恒溫箱(200rpm)上于室溫孵育1小時。然后將板用洗滌緩沖液漂洗三遍，向板中添加50μl?1-steptmultra?tmb-elisa等分試樣，在5分鐘后通過添加2m硫酸(50μl/孔)終止hrp反應。在450nm處測量hrp反應。a450處的值可以表示snap25197的相對量。

241、實施例6-2.標準曲線的制備及bont/a效價的測定

242、計算未經bont/a處理(即0pm)進行夾心elisa的對照孔的平均a450值。從測試a450值中減去平均對照a450值，然后計算標準化的平均測試a450值。然后，使用prism?5.0(graphpad?software，la?jolla，ca)在y軸上的標準化平均a450值對x軸上的bont/a效力作圖。通過依次選擇“分析”，“非線性回歸(曲線擬合)”和“s形劑量響應”來分析圖，這將產生ec50值。使用經0.1～0.93pm?bont/a標準參照物處理的測試孔的歸一化a450值繪制標準曲線(請參閱附錄2，d部分)。并使用r2值為0.95或更高的標準曲線方程式確定測試樣品的bont/a效力。

243、實施例7：特異性針對snap25的單克隆抗體的生產

244、allergan使用了13個氨基酸(aa)的殘留肽n-cdsnktrideanq-c來產生抗體。將該肽設計為與bont/a消化后產生的snap25197的c末端相同。由于snap25fl也具有相同的氨基酸序列，因此可以合理地認為，識別snap25197的單克隆抗體的特異性可歸因于snap25197尚未鑒定的特征而不是其主要氨基酸序列。snap25由206aa殘基組成(圖8)。通過snare圖基序，其與突觸融合蛋白1a和小突觸泡蛋白2(vamp2)形成一個穩定的三元復合物。snap25197形成較不穩定、和非功能性的三元復合物，而snap180無法形成三元復合物。他們發現snap25的c末端的9aa對于體內功能至關重要，并且穩定的三元復合物的形成表明，由bont/a誘導197位aa處的切割仍未鑒定到結構改變，特別是在c-末端和第二snare結構域。因此，snap25fl和snap25197之間假定的結構差異可以產生特異性針對snap25197的單克隆抗體。

245、設計了10種肽抗原以滿足以下兩種標準。首先，排除表現出較低抗原性的α螺旋區。其次，肽序列是非冗余的且獨特的，其性質對于降低抗體的交叉反應性是必不可少的。根據上述標準設計的十種肽抗原序列顯示在下表6中。

246、表6

247、

248、在表6中描述的總共10個肽中，m和n個肽用于生成能夠同時檢測snap25fl和snap25197的單克隆抗體。對于c肽，預計獲得三種針對(1)snap25fl，(2)snap25197和(3)snap25fl和snap25197具有結合特異性的單克隆抗體。在我們的整個研究過程中，兩種市售抗體被用作elisa和western印跡分析的對照。它們包括兔多克隆抗snap25?igg(sigma-aldrich)和mc6050(r&d)。前者識別snap25fl和snap25197，但后者是對snap25197具有特異性的單克隆抗體。

249、將每種合成肽注射到兩只兔子中得到多克隆抗體血清，注射到4只小鼠中得到單克隆抗體血清。產生單克隆抗體的雜交瘤細胞的建立過程如圖9所示。簡而言之，每種肽抗原免疫四只小鼠以誘導抗體產生。在對小鼠血清進行elisa篩選后，從elisa陽性小鼠中分離脾細胞并與sp2骨髓瘤細胞融合。隨后，將雜交瘤細胞作為單個細胞接種到每個肽抗原的96孔板中。對于陽性雜交瘤細胞的選擇，通過篩選7x?96孔板，篩選出elisa反應性最高的24個克隆，然后與重組snap25進行elisa和western印跡反應，從中選出反應性和敏感性最高的5個克隆。為從5個陽性克隆中分離出單細胞，將5個克隆作為單細胞接種于96孔板中，通過elisa隨機選取10個克隆，評價其檢測肽抗原的活性。此后，當所有10個克隆均被確認為陽性時，在elisa和western印跡中重新評估其對重組snap25的反應性和敏感性。初始雜交瘤篩選的代表性結果如圖10所示。收集在7×96孔板中生長的雜交瘤細胞(克隆4，b4)的培養上清液，通過直接elisa評價其反應性。結果，發現大約25％的克隆對elisa呈陽性(圖10a和圖10b)，從中選出表現出較強陽性的24個克隆，并通過夾心elisa使用其細胞裂解物檢測它們對內源性snap25的反應性(圖10c)。選擇十個克隆進行單細胞克隆選擇。

250、對于單細胞克隆選擇，將雜交瘤克隆以單細胞密度接種在一個96孔板中。四天后，通過直接elisa測試培養上清液對重組snap25的反應性，并選擇五個產生相對強elisa信號的克隆用于進一步分析。例如，對于克隆4，在96孔板上生長的超過80％的亞克隆在直接elisa中被檢測為陽性(圖11a)。十二個亞克隆產生的elisa信號低于陰性對照，包括a8-a10，b11，c10，d4，d8，d9，e5，e11，f10和g7(圖11a)。如材料和方法中所述，還使用總細胞裂解物(tcl)通過夾心elisa(圖11b)和western印跡(圖11c)分析了五個亞克隆。應當注意，具有克隆4的亞克隆的elisa信號與蛋白質印跡信號非常吻合。鑒于tcl在蛋白質印跡分析過程中經歷了變性，因此該結果表明雜交瘤克隆4產生的單克隆抗體均與未變性(即elisa)和變性snap25反應。

251、單細胞克隆選擇重復兩輪，如圖12和圖13所示。在第二輪選擇后，將兩個克隆6和8從進一步的篩選中剔除，因為96孔板中的所有培養上清液均無法產生顯著高于陰性對照的elisa信號。通過一系列單細胞克隆選擇，獲得了總共12種雜交瘤克隆，其產生了對snap25fl，snap25197或兩者特異的單克隆抗體。

252、實施例8：單克隆抗體的生產和純化

253、雜交瘤細胞在t175燒瓶中擴增并用于制備母細胞庫。為了產生單克隆抗體，從儲存在液氮氣相中的儲備小瓶中回收雜交瘤細胞。當細胞達到約90％的密度時，將其在多個t175燒瓶中按1：4～10進行亞培養。孵育3-4天后，通過離心收集細胞并以1.0×106個細胞/ml重懸于無血清培養基中。孵育4天后，收集培養上清液并使用蛋白g柱(蛋白g?hp柱)純化igg，如材料和方法所述。使用培養上清液純化的單克隆抗體的產量在不同批次的雜交瘤培養物中也有所不同，對于單個雜交瘤克隆也是如此。用不同批次的培養上清液(165～542ml)進行十幾次純化，得到約2.45～5.52mg的c16?igg(表7)。

254、表7

255、

256、其他多克隆抗體的純化結果總結在表8中。

257、表8

258、

259、

260、從100ml培養上清液中平均獲得約1-2mg?igg。盡管未顯示數據，但通過sds-page和elisa驗證了igg的純度及其抗原結合特異性。

261、實施例9：生產和純化多克隆抗體

262、如上述制備實施例中所述，使用snap25-affigel從兔血清中純化多克隆抗體。表9總結了用4個不同批次的ra15血清獲得的snap25-affigel組分中血清蛋白的相對分布。

263、表9

264、

265、盡管每個血清樣品在snap25-affigel組分中均表現出不同的蛋白分布模式(表9)，但通過10％sds-page檢測，igg被檢測為所有組分的主要成分(圖14a)。但是，當在夾心elisa中進行測試時，僅在ph?4.0時檢測到對內源性snap25的反應性。高信噪比(>25)(圖14b)表明，ph?4.0的組分中的igg對內源性snap25具有高度特異性。由于使用其他兔血清獲得了相似的結果，因此除非另有說明，否則在我們采用多克隆血清的整個研究中，僅使用ph4.0組分。

266、在圖14a中，泳道m表示尺寸標記；泳道1代表流通；泳道2表示在ph5.5處的洗脫igg池；泳道3表示ph?4.0的洗脫igg池；泳道4表示ph?2.5的洗脫igg池；并且泳道5表示ph11.5的洗脫igg池。

267、實施例10：單克隆抗體的序列分析

268、使用oligo-dt反義引物或基因特異性(鼠igg1?ch和kappa?cl)反義引物將從雜交瘤細胞中提取的總rna逆轉錄為cdna。使用特異性鼠類恒定域引物通過pcr擴增cdna，以確定抗體的同種型。簡并的vh和vl引物用于從cdna擴增可變域。對于5'race，將均聚物[dc]尾部添加到cdna的3'端。然后用寡核苷酸[dg]有義引物和基因特異性(ch/kc)反義引物擴增重鏈和輕鏈。將pcr產物克隆到平端或ta載體中以進行測序。將測序結果與vh和vl鏈比對以確定共有序列。

269、cdr序列歸納為：(1)snap25fl-特異性igg(表10)，(2)snap25197特異性igg(表11)，以及(3)與snap25fl和snap25197特異性的igg(表12)。

270、表10

271、

272、

273、表11

274、

275、

276、表12

277、

278、在表13中總結了本發明中產生的抗體的vh和vl結構域序列。

279、表13

280、

281、

282、

283、

284、值得注意的是，vlcdr3序列由snp25197特異性igg共享，例如c4，c7，c14，c15和c16igg，而它們的vh序列往往是igg特異性的(表11)。序列比對分析顯示，表10-12中列出的igg的單個cdr序列與先前報道的igg的vl和vh?cdr序列不重疊(美國專利us8198034b2)。這可以歸因于在本研究中使用陽性雜交瘤細胞進行更嚴格的篩選策略。也就是說，在多輪篩選中，通過使用肽抗原的直接elisa，使用tcl的夾心elisa和使用tcl的western印跡分析僅選擇了三重陽性雜交瘤克隆。這種嚴格的篩選策略有助于顯著降低本研究中獲得的igg的kd值)。

285、實施例11：單克隆抗體的動力學分析

286、如“上述制備實施例”中詳細介紹的，按照制造商建議的步驟，使用fortéoctet?red96儀器通過bli分析進行單克隆抗體的動力學分析。首先，使用負載有重組gst-snap25197(125nm或250nm)的抗gst生物傳感器，對snap25197特異性igg進行動力學分析。圖15顯示了用c4，c7，c16和c24獲得的一組動力學曲線，作為這種研究的示例。簡而言之，將負載gst-snap25197的抗gst生物傳感器依次浸入1x動力學緩沖液，連續稀釋的igg樣品(7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500nm)(分析物結合)和1x動力學中緩沖液(分析物解離)。在分析物結合和解離各10分鐘之后，獲得了動力學曲線的原始數據(圖15a)。然后通過減去基線bli信號(圖15b)校準動力學曲線，使用octet分析軟件估算kd。

287、在圖15中，負載在amc生物傳感器上的igg包括c16?igg(i)、c24?igg(ii)、c4?igg(iii)和c7?igg(iv)。此外，“a”代表抗體負載，“b”代表洗滌，“c”代表抗原結合，“d”代表抗原解離。

288、分析結果示于表14。

289、表14

290、

291、考慮到kd值的nm范圍，動力學分析似乎能通常進行。但是，當使用浸入較低濃度gst-snap25197(125nm)的生物傳感器進行動力學分析時，kd值成比例降低，這主要是由于解離速率常數kdis的變化所致(表14)。同樣奇怪的是，具有相似抗原特異性的單克隆抗體的kdis值(1.22～5.09x10-3)比以前報道的值(3.11x10-4～6.74x10-5)低1或2個數量級(美國專利us8198034b2)。

292、對于相對高的kd和kdis值，可以考慮兩個合理的原因。第一個是不合適的測定緩沖液的使用，第二個是使用抗gst生物傳感器進行整個動力學測定的固有局限性(fortébio應用說明14：在octet平臺上進行的生物分子結合動力學測定)。在動力學分析中比較使用各種分析緩沖液表明，在所有測試緩沖液中，最合適的是1x動力學緩沖液(數據未顯示)。作為替代動力學分析，抗小鼠igg?fc捕獲(amc)生物傳感器直接負載抗體，并與連續稀釋的gst-snap25進行締合/解離。簡而言之，將純化的igg稀釋至100或200nm，而gst-snap25fl或snap25197連續稀釋至1.56,3.125,6.25,12.5,25,50和100nm。在1x動力學緩沖液中平衡1分鐘后，將amc生物傳感器裝載igg?10min，然后將其浸入1x動力學緩沖液中10min。分析物的締合和解離各進行10min，并如上所述估算kd。交替動力學曲線的原始數據見圖16a，通過kd估算整理的數據見圖16b。在圖16中，負載在amc生物傳感器上的igg包括c14(i)、c24(ii)、d2(iii)、d6(iv)、e6(v)和a15(vi)。此外，“a”代表抗體負載，“b”代表抗原結合，“c”代表抗原解離。

293、使用octet分析軟件估計的kd值列于表15中。

294、表15

295、

296、最值得注意的是kdis值(即2.57×10-6～1.0x10-7)(表15)，其比用抗gst生物傳感器獲得的低二至三個數量級(表14)。實際上，解離速率太低，無法使用fortéoctet進行精確測量，因此，暫定給出了六個igg的的最低限度的kdis值，1.0x10-7，如表15所述。用這些暫定解離速率常數得到估算kd值為0.48～3.27pm。應該注意的是，負載有snap25197特異性igg的amc生物傳感器高達1μm的gst-snap25fl的結合的沒有統計學上的顯著性。類似地，gst-snap25197與負載有snap25fl的amc生物傳感器沒有結合。igg的這些結合特異性與其在elisa中的反應性非常吻合。

297、實施例12：單克隆抗體的抗原結合特異性的確認

298、使用直接elisa和western印跡分析比較地檢查了單克隆抗體對snap25fl和snap25197的反應性。首先，如材料和方法中所述，在包被gst-snap25fl或gst-snap25197的微孔板上，用純化的igg(每孔50ng)進行直接elisa。hrp反應進行5分鐘，并使用bio-teksynergyneo2通過測量a450確定hrp活性的程度。減去背景a450后獲得a450值，在不使用igg的情況下進行測量，計算出snap25197的a450與snap25fl的a450的比率，在表16中表示為ratio197/206。與通過bli分析獲得的結果一致，雙特異性igg(例如a15，b4和b23)的197/206比率值接近1.0。snap197特異性igg(例如c7，c14，c16和c24)的ratio197/206值超過950，但snap25fl特異性igg產生0.02～0.03的ratio197/206。

299、表16

300、 igg <![cdata[snap25_fl的a₄₅₀]]> <![cdata[snap25₁₉₇的a₄₅₀]]> <![cdata[ratio_197/206]]> a15 1.383 1.445 1.04 b4 2.163 1.797 0.83 b23 1.901 1.754 0.92 c4 0.001 0.919 919 c7 0.001 1.199 1,037 c14 0.001 0.953 953 c16 0.001 0.996 996 c24 0.001 0.973 973 d3 0.125 1.616 12.93 d2 1.448 0.048 0.03 d6 1.878 0.031 0.02 e6 1.808 0.039 0.02

301、用雜交瘤培養上清液(1：100稀釋)作為一抗的來源進行蛋白質印跡分析將gst-snap25fl和gst-snap25197的等分試樣(0.5μg)溶解在變性凝膠上，隨后轉移到pvdf膜上，作為抗原進行測試單克隆抗體與變性的snap25抗原以與elisa分析中相同的特異性反應(圖17)。在圖17中，泳道1表示snap25fl，泳道2表示gst-snap25197。

302、實施例13：辣根過氧化物酶(hrp)與抗體的綴合

303、在測試的單克隆抗體中，與hrp輟合后，c16?igg表現出最可再現的抗原親和力和特異性保留(數據未顯示)。在典型的hrp輟合反應中，如材料和方法中所述，將c16?igg(5mg)與活化的hrp(5mg)在室溫避光下孵育2小時。加入0.1ml硼氫化鈉(4mg/ml)后，將hrp-抗體輟合物在4℃下針對1x?pbs和1x?pbs/50％甘油進行透析(圖18)。

304、如圖18a所示，活化的hrp與c16?igg的輟合非常有效，即使不孵育也可以檢測到c16?igg-hrp結合物的形成(比較第1-3條泳道)。c16?igg的不完全綴合反映為游離igg和hrp(泳道4-6)，提示提出在反應混合物中需要相對高濃度的游離hrp和igg才能有效結合。在圖18a中，泳道m表示尺寸標記；泳道1代表未綴合的c16?igg(9mg)；泳道2代表激活hrp(4mg)；泳道3代表在孵育之前(4.5mg)的c16?igg/hrp混合物(c16?igg-hrp)；泳道4表示孵育后的c16?igg-hrp(4.5mg)；泳道5表示封閉(4.3mg)后c16?igg-hrp；在通過透析除去游離hrp后，以及泳道6代表c16?igg-hrp(4.3mg)。此外，“a”代表c16?igg-hrp輟合物。

305、在直接elisa中檢查了兩種不同的c16?igg-hrp綴合物對snap25197的反應性。將96孔微孔板包被有0-200pg的gst-snap25197，模擬在微孔板上生長的細胞中內源性snap25的裂解率最高可達～0.8％。當用50μl的1-steptm?ultra?tmb-elisa測量30分鐘時，等分試樣(200ng)的c16?igg-hrp輟合物能夠檢測低至50pg的gst-snap25197(圖18b)。另外，與增加的gst-snap25197量成比例地獲得了更高的a450值。基于這些結果，在優化的夾心elisa中，c16-hrp輟合物專門用于檢測抗體。

306、實施例14：生物素與抗體的綴合

307、由allergan開發的夾心elisa利用兩種抗體：snap25197特異性igg作為捕獲抗體和多克隆snap25特異性igg作為檢測抗體。相比之下，本研究發明的夾心elisa利用兩種單克隆抗體作為捕獲任一種檢測抗體，這使其質量控制更加可行和容易。這種新型的夾心elisa具有很高的重復性，再現性和準確性。然而，添加第二種檢測抗體(例如與堿性磷酸酶或生物素綴合的igg)可以通過標準化每個孔中捕獲的snap25來進一步提高夾心elisa的準確性。

308、作為首次嘗試，如材料和方法中所述，將雙特異性單克隆抗體a15與生物素輟合。如圖19所示，提供的生物素濃度越高，每個igg輟合的生物素分子越多。使用haba/抗生物素蛋白預混物(avidin?premix)(thermo?scientific)對生物素輟合的定量分析表明，在提供0.25mm生物素的反應中，每摩爾igg輟合了約8摩爾生物素。一致地，與0.5mm生物素輟合的igg重鏈在sds-page上的遷移明顯較慢(圖19a和19b)。圖19a和19b中，泳道m表示尺寸標記；泳道1代表a15?igg；泳道2表示與0.1mm生物素綴合的a15?igg；泳道3表示與0.25mm生物素綴合的a15?igg；并且泳道4表示與0.5mm生物素綴合的a15?igg。

309、在夾心elisa中測試了與0.1mm生物素輟合的a15?igg的反應性。簡而言之，從指定濃度的bont/a處理的n2-42f細胞中制備tcl(60μl)將涂有b4?igg的微孔層與50μl的tcl等份孵育。通過與a15-生物素綴合物和鏈霉親和素-ap綴合物(在1x?tbs中以1：500稀釋)孵育，檢測到被b4?igg捕獲的內源性snap25197。作為雙特異性單克隆抗體，a15?igg已被表征具有相當的親和力和特異性以結合snap25fl和snap25197(參見圖17)。出于標準化目的，這些特性是選擇a15?igg作為潛在的第二種檢測抗體的標準。因此，預期a15與snap25的結合仍然不受snap25切割程度的影響。然而，相反，反映生物素化a15?igg的snap25結合的ap活性與bont/a濃度成比例增加(圖19c)。igg輕鏈和重鏈經過生物素化后，其抗原特異性的變化可能解釋了這一結果(圖19b)。

310、實施例15：堿性磷酸酶(ap)與抗體的直接交聯

311、作為第二種檢測抗體的替代方法，使用戊二醛將純化的igg直接與ap交聯，因為交聯的程度可以由戊二醛濃度調節。使用戊二醛將兩種多克隆抗體和三種單克隆抗體與ap交聯。除c16外，它們都是與snap25fl和snap25197反應的雙特異性抗體，這是用于標準化的第二檢測抗體的關鍵特性。c16?igg被用作對照，因為hpr綴合是有效的，并不影響c16的抗原特異性(圖18)。

312、為了尋找獲得保留其抗原特異性和反應性的ap-igg綴合物的最佳條件，在不同的孵育條件下，以不同的igg與ap比例進行ap與igg的交聯(表17)，戊二醛交聯完成后得到的ap-igg偶聯物通過sds-page進行分析。

313、表17

314、

315、

316、完成戊二醛交聯后，通過sds-page分析所得的ap-igg綴合物。代表性的結果顯示了ap-igg輟合物的電泳分離度，隨后通過考馬斯亮藍染色可視化顯示在圖20中。簡而言之，在提供有0.2％戊二醛的反應中，將多克隆抗snap25?igg(sigma)交聯至ap。ap的交聯非常高效，因此所有提供的igg與ap形成高分子量復合物。所得的ap-igg輟合物在sds凝膠上的遷移要慢得多，有些不能進入積層凝膠部分(圖20a)。通過測試的所有igg獲得類似的條帶圖(數據未顯示)。在圖20a中，泳道m代表大小標記，泳道1代表未輟合的igg，泳道2代表ap，泳道3代表ap-igg輟合物。此外，“a”代表聚丙烯酰胺凝膠的濃縮凝膠部分，“b”代表ap-igg輟合物。

317、通過sds-page分析確認交聯后，在直接elisa中，使用2ng含有不同濃度gst-snap25197的gst-snap25混合物包被的微孔板來比較檢測ap-ra15?igg和ap-sigma?igg綴合物(每孔100ng)的抗原反應性和特異性。ap-sigma?igg綴合物未產生任何elisa信號，而ap-ra15?igg綴合物產生的結果與生物素化a15?igg相似(比較圖19和圖20b)。隨著gst-snap25197量的增加，使用ap-ra15?igg輟合物可獲得更高的elisa信號。圖19和20中的結果表明，在發生snap25fl反應的抗體的情況下，作為單克隆抗體或多克隆抗體，igg的重鏈和輕鏈均有效輟合至活化的生物素或通過戊二醛與ap交聯。

318、實施例16：優化n2-42f的細胞培養，以及bont/a毒素的處理

319、已經獲得例如對bont/a高度敏感的神經元細胞和對snap25特異的單克隆抗體的關鍵試劑，并進行了一系列實驗以優化基于細胞的效價測定的所有步驟，包括毒素培養基，敏化劑(sensitizer)，bont/a處理時間，以及捕獲/檢測抗體配對。因此，可以對肉毒桿菌毒素細胞測定的所有步驟進行優化。

320、實施例16-1.毒性時間的優化

321、首先，優化bont/a的處理時間(毒素化時間)。方案a(圖21a)是針對sima優化的標準化cbpa流程。為了檢查方案a的bont/a敏感性，將n2-42f細胞以5.6x105個細胞/孔接種在12孔培養板中，第二天，將培養基替換為不含gt/1b的1x毒性培養基。兩天后，向培養基中補充gt1b(25mg/ml)，再培養一天后，向培養基中添加含bont/a的1x毒性培養基，再培養2天。方案b(圖21b)是在本研究中開發的cbpa流程。簡而言之，將n2-42f細胞以5.6×105個細胞/孔接種在12孔培養板中，并在第二天，用含有25pm?bont/a的1×毒性培養基代替該培養基。在指定日通過添加1x?sds樣品緩沖液(每孔200μl)制備細胞裂解液，在使用前于-20℃儲存。將試樣(12μl)進行12％sds-page，并使用多克隆抗snap25?igg(sigma?s9684，1：8,000稀釋度)和山羊抗兔igg?fc-hrp(abfrontier?lf-sa8002，1：8,000稀釋度)，通過western印跡檢測snap25fl和snap25197。snap25裂解的程度使用image?lab軟件(bio-rad)進行定量。

322、如上所述，為了建立針對n2-42f細胞的最佳中毒時間，通過延長在沒有gt1b的1x毒性培養基或在含有bont/a的1x毒性培養基中的細胞培養時間來修改方案a。這些變化并沒有改善snap25的裂解程度，此外，在1x毒性培養基中生長超過4天的n2-42f細胞在顯微鏡下看起來非常不健康(數據未顯示)。基于此觀察結果，，通過縮短在添加了gt1b和bont/a的1x毒性培養基中的培養時間(圖21b)，建立了新的方案b。隨著時間變化，從細胞接種后的第三天(d4)開始，通過western印跡比較分析了n2-42f細胞中snap25切割的程度。如圖21c所示，在d4估計snap25裂解的比例不到20％，但是在d4補充了gt1b和bont/a的毒性培養基中，n2-42f細胞在d4以后的延長培養導致snap25裂解的顯著增加到d7的64％。由于在顯微鏡下d7上的n2-42f細胞看起來不健康，因此將d6確定為n2-42細胞收獲和夾心elisa分析以測量bont/a效力的一天。

323、實施例16-2.優化毒素培養基

324、滲透壓和溫度影響bocelltm的bont/a敏感性(美國專利us9526345b2)。此外，優化神經分化培養基可顯著提高ng108-15細胞的bont/a敏感性(j?biomol?screen.2016jan；21(1):65-73)。由于bont/a敏感性反映了通過細胞表面上兩個獨立的受體多聚唾液酸神經節苷(psg)受體和蛋白受體(sv2)攝取bont/a的程度(j?neurochem.2009jun；109(6)):1584-95)，因此通過優化培養基或更高溫度來增強提高bont/a的敏感性促進bont/a的細胞攝取。

325、為此，在三種不同的培養基中測試了n2-42f細胞對bont/a的敏感性：rpmi1640，neurobasaltm和mem，全部添加有1x?n2，1x?b27和1x?gt1b。在指定培養基中培養時，根據方案b，用不同濃度(0.93～25pm)的bont/a細胞處理n2-42f細胞。

326、當通過western分析測量時，n2-42f細胞的bont/a敏感性用rpmi1640測量得最高(圖22)。用neurobasaltm或mem測量的的bont/a敏感性比rpmi1640低25％或50％。在所有培養基中，kcl含量通常為5,33mm，但在rpmi1640中，nacl的濃度為103mm，在mem中為117mm，在neurobasaltm培養基中為52mm。盡管存在這種差異，但已知大多數脊椎動物細胞的滲透壓都保持在260mosm/kg至320mosm/kg的狹窄范圍內(atcc培養細胞指南)。但是，rpmi1640中n2-24f細胞的bont/a敏感性可能是由滲透壓以外的尚未確定的培養基成分引起的。

327、在圖22中描述的條件下，約48％的內源snap25在n2-42f細胞中被8.33pm?bont/a裂解，相當于約10單位/ml的效力。由于96孔板中的培養體積為0.1ml，因此在微孔板上每孔bont/a的生物效力的ec50估計為～1u。因此，按照方案b用n2-42f細胞測量的bont/a敏感性，其足夠敏感從而可以通過小鼠ld50生物測定法確定bont/a的生物效力。

328、實施例16-3.敏化劑的優化

329、對影響神經存活或分化的化合物增敏劑進行了優化，包括已知影響bont/a敏感性的精氨酸atp(fields和stevens，2000)、肌酸(andres等，2005)和硫辛酸(grasso等，2014)。為此，用0.03至5.5pm的bont/a處理n2-42f細胞并使用snap25特異性單克隆抗體通過夾心elisa方案b進行分析，分析結果如圖23所示。實驗結果表明，當在1x毒素培養基中加入1mm肌酸或5mm精氨酸時，bont/a敏感性顯著增強，因此ec50值從2.51pm分別下降到2.13至2.03pm。相比之下，atp和硫辛酸作為非常有效的抑制劑，因此即使在25pm的bont/a濃度下也未檢測到n2-42f細胞中的snap25裂解。

330、在對毒性培養基的優化研究中，據信n2-24f細胞的呼吸敏感性受滲透壓以外的因子的影響。因為rpmi1640培養基中的敏感性高于neurobasaltm或mem培養基。對于培養基組合物中的精氨酸，其在rpmi1640中的含量為1.15mm，在mem中的含量為0.6mm，在neurobasaltm中的含量為0.4mm。由于精氨酸是肌酸的前體氨基酸，因此使用2x含2～10mm精氨酸的毒素培養基進一步檢查了精氨酸對bont/a敏感性的影響。如圖23b所示，隨著精氨酸濃度的增加至5mm，bont/a敏感性逐漸提高，通過降低的ec50值反映出來。盡管仍高于對照(ec50＝2.94pm)，但使用10mm精氨酸(ec50＝2.34pm)的bont/a敏感性要低于使用5mm精氨酸(ec50＝1.65pm)的bont/a敏感性。基于該結果，盡管其作用機理還有待了解，但cbpa的優化標準方案使用了含有5mm精氨酸的毒素培養基。

331、2002年，schengrund及其同事首次提供了實驗證據，即在neuro-2a細胞中，bont/a對snap25的有效切割需要dmem中的gt1b高于25μg/ml。由于n2-42f細胞來源于neuro-2a，因此通過western印跡分析使用含有25-75μg/ml?gt1b(1～3x?gt1b)的1x毒性培養基來檢測bont/a活性對gt1b的要求。如果不添加gt1b，則8.3pm?bont/a導致約18％snap25裂解(圖24a)。在n2-42f細胞中，添加1x或3x?gt1b導致8.3pm?bont/a的snap25切割分別增加10％和18％(圖24a)。為了優化gt1b的濃度，在2x含25pm?bont/a的毒素培養基中測試了n2-42f細胞的bont/a敏感性，并將gt1b的濃度從1x增加到5x。通過western印跡分析進行測量時，通過添加1x或2x?gt1b可以顯著增強snap25的切割，但是當gt2b超過2x時，snap25的切割略有增加，從63％，65％，68％到70％(圖24b)。采用優化的夾心elisa進行并行試驗。考慮到夾心elisa的敏感性，按照方案b，在2x毒性培養基中以0.93pm?bont/a處理n2-42f細胞。夾心elisa更深刻地展現了bont/a活性對gt1b的需求。簡而言之，當在gt1b缺少的毒性培養基中用bont/a處理n2-42f細胞時，在夾心elisa中獲得相對較低的a450值(圖24c)。相比之下，向毒素培養基中添加gt1b導致a450值顯著增加結果表明，直到2x?gt1b中，a450值穩定增長，這可能反映了bont/a，gt1b和多唾液酸神經節苷脂(psg)受體之間有效且穩定的三分子相互作用。因此，可以通過psg受體飽和和/或摩爾過量的游離gt1b與bont/a-gt1b復合物競爭psg受體來解釋用4x?gt1b時獲得的飽和a450值，甚至用5x?gt5b時降低的a450值。基于這種推理，當使用n2-42f細胞測量bont/a活性時，選擇2x即50μg/ml作為gt1b的最佳濃度。

332、測試了n2(n2補充劑，賽默飛世爾科技17502048)/b27(b27tm無血清補充劑，賽默飛世爾科技17504-044)在神經元培養物中對bont/a敏感性的影響。含有所有反式視黃醇(0.1mg/l)的b27可支持神經祖細胞的運動神經元分化(j?cell?biochem。2008年10月15日；105(3)：633-40)。n2包含b27成分的一個子集，包括胰島素，并且已知會促進(1)人類胚胎干細胞的分化和(2)神經祖細胞的增殖/存活(j?cell?biochem.2008oct?15；105(3):633-40)。按照方案b，n2-42f細胞的bont/a敏感性,在rpmi1640中添加有1x?gt1b，8.3pm?bont/a和指定濃度的n2/b27。按照western印跡定量分析snap25裂解。如圖25a所示，總snp25(snap25fl+snap25197)的細胞內水平與n2/b27濃度成比例增加，而snap25197的水平保持相對不變，甚至在4x或5x?n2/b27存在的情況下甚至降低。最近的一項研究報道，n2和b27共同發揮作用，通過限制糖酵解來保護神經元避免葡萄糖消耗后的細胞死亡(front?molneurosci.2017sep?29；10：305)。作為在含有低濃度葡萄糖的無血清rpmi1640培養基中促進細胞增殖和存活的功能的一部分，還確定隨著n2/b27濃度的增加，snap25合成增加。

333、此外，使用補充了3x?gt1b和5mm精氨酸的rpmi1640，進一步檢查了n2/b27對bont/a活性的影響。盡管snap25的總細胞內水平顯著增加，但用8.3pm?bont/a處理的n2-42f細胞中snap25的裂解程度在1x和2x的n2/b27中從13％增至56％，69％(圖25b)。基于該觀察，將2x?n2/b27添加到優化的毒素培養基中。

334、實施例17：夾心elisa的優化

335、實施例17-1.緩沖液優化

336、為優化夾心elisa條件，在elisa中比較了11種不同的細胞裂解緩沖液，選擇的最佳條件見表18和表19。表18

337、

338、表19

339、

340、

341、實施例17-2.捕獲抗體處理的優化

342、其次，比較了三種雙特異性抗體a15，b4和b23在夾層elisa中作為捕獲抗體的功能。tcl是從n2-42f細胞中制備的，該細胞在1x毒性培養基中用不同濃度(0-25pm)的bont/a處理。將tcl添加到涂有指定抗體(每孔400ng)的微孔板中。在4℃下孵育4小時后，按照“材料和方法”中所述的步驟，使用c16?igg-hrp綴合物檢測并定量由所示抗體捕獲的snap25中的snap25197的量。一個例外是hrp反應進行30分鐘，直到所有測試組均產生陽性elisa信號。如圖26a所示，a15，b4和b23?igg的估計ec50值分別為15pm，0.7pm和5.5pm。該結果與snap25fl和snap25197的kd值一致。

343、按照方案b，通過在含有指定濃度bont/a的2x毒性培養基中孵育的n2-42f細胞制備的tcl探索了最佳b4?igg量，用包被有增加量的b4?igg(每孔100～400ng)的微孔板進行夾層elisa。在4℃下孵育4小時后，如上所述檢測捕獲的snap25197并使用c16?igg-hrp綴合物進行定量。應當指出的是，hrp反應進行了15分鐘。如圖26b所示，隨著b4?igg量從100ng增加到300ng，ec50值穩定降低。400ng?b4?igg對ec50的影響在統計學上沒有進一步的顯著改善。總之，在優化的夾心elisa中，將300ng?b4?igg用作捕獲抗體的標準量。

344、實施例17-3.檢測抗體處理的優化

345、在指定的條件下，將用8.33或25pm?bont/a在1x毒性培養基中處理過的sima細胞制備的tcl在微孔板中孵育。隨后，使用c16?igg-hrp綴合物檢測和定量捕獲的snap25197。如圖27a所示，當微孔板在4℃下孵育4小時時，snap25197的elisa信號最高，而在37℃下孵育1小時后，elisa信號非常弱。盡管未顯示數據，但使用n2-42f細胞的tcl可獲得相似的結果，并且經過4個小時以上的孵育后elisa信號沒有明顯改變。因此，在優化的夾心elisa中，將tcl在4℃時孵育4小時。

346、通過直接elisa探索了檢測抗體的最佳溫育條件。簡而言之，微孔板用不同量(10pg至1ng)的重組gst-snap25197包被，代表標準cbpa中有0.05％至50％的內源性snap25裂解。加入c16?igg-hrp輟合物(每孔200ng)后，在指定條件下孵育微孔板。在條件測試中，cg16?igg-hrp輟合物在室溫下孵育1小時，可在所有檢測到的gst-snap25197范圍內產生最高的elisa信號，但其他條件也可產生可接受水平的elisa信號。考慮到隨后的hrp反應在室溫進行，在優化的夾心elisa中，將c16-hrp輟合物在室溫下孵育1小時。

347、實施例17-4.c16?igg-hrp綴合物檢測的優化

348、通常使用常規tmb底物(1-steptm?ultra?tmb-elisa)測量hrp活性。使用tmb底物的一個缺點是ec50值容易受到hrp反應時間的影響(圖26和29)。較長的hrp反應產生較低的ec50。作為一種替代檢測方法，在夾心elisa中比較了熒光測定法。除了提供的hrp反應底物外，在整個夾心elisa中基本上按照相同的方式平行進行比色和熒光測定。熒光和比色法測量產生的ec50為0.66和0.78pm(圖28)，并且兩個ec50值同樣受到hrp反應時間的影響(數據未顯示)。總之，盡管對hrp反應進行熒光測定必須使用黑色微孔板和內置熒光計的微孔板讀取器，但兩種測量都足夠準確靈敏，足以在優化的elisa中檢測c16?igg-hrp綴合物的活性。

349、實施例18：cbpa的驗證

350、實施例18-1.優化的cbpa時間線的檢查

351、圖29是用于測定本發明的肉毒桿菌毒素活性的夾心elisa方法的示意圖。如圖29所示，本發明的肉毒桿菌毒素活性測定夾心elisa方法僅需3個工作日即可完成分析。簡而言之，一天接種細胞，一天更換含有bont/a(0.1-10u/ml，或小于4pm)的培養基；。在細胞接種的第6天，需要一天時間來裂解細胞并分析夾心elisa。另外，由于第一天和第二天的工作時間為1～2小時，因此本發明的肉毒桿菌毒素活性測定夾心elisa法非常省時。此外，由于本發明的夾心elisa使用單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體，抗體管理比使用多克隆抗體容易得多，從而進一步鞏固了cbpa的可靠性。。

352、實施例18-2.cbpa的準確性和線性的檢查

353、在標準方案b之后，三個操作員總共進行18個cbpa。

354、由三個操作員按照方案b共進行18個cbpa。n2-42f細胞用含有不同濃度(0、0.03、0.1、0.2、0.31、0.62、0.93、2.78、5.55、8.33pm)的bont/a的2x毒性培養基(圖30a)處理，或2x含3xgt1b的毒性培養基(圖30b和圖30c)。hrp反應進行5分鐘(圖30a和圖30b)或9分鐘(圖30c)，并使用gen5軟件確定ec50。通過用0.1到0.93pm?bont/a處理n2-42f細胞獲得的a450值進行線性回歸分析來計算檢測限(dl)和定量限(ql)，結果如圖30所示。

355、第一系列的cbpa產生1.39pm的ec50，檢測限(dl)為1.5fm(3.4mu相對效能/ml)，定量限(ql)為4.6fm。由于1.39pm?bont/a相當于每次測定的～0.3u相對效能，因此第一個cbpa足夠靈敏，可以測量bont/a的生物效能來代替小鼠ld50測定。通過在第二系列cbpa中進行長時間的hrp反應，可獲得稍低的ec50值1.24pm(圖30b)。以前已經注意到hrp反應時間對ec50的影響(圖29)。使用具有3x?gt1b的毒性培養基進行的第三系列cbpa產生的ec50最低為1.09pm，與圖27中的結果一致。結果表明，通過調節hrp反應時間或改變中毒培養基中gt1b的濃度，可以調節本研究中cbpa的定量能力和檢測限。用0.03～0.93pm?bont/a處理的n2-42f細胞的elisa信號的線性回歸分析顯示，在所有三個系列的cbpa中，bont/a的相對效價與elisa信號之間都具有極好的線性相關性(圖30)。該結果表明，cbpa不僅在每次測定中測量bont/a在6.8mu和0.2u之間的相對效力時非常敏感，而且非常準確。

356、實施例18-3.測量bont/a樣品中的生物效力

357、bont/a(hugel,韓國)中的效力由小鼠ld50確定。為了使用cbpa測量這種生物效能，將(每小瓶200u)的兩個不同批次(hub?18009和hub18011)溶解毒性培養基(基質a)，去離子水(基質b)或5mm精氨酸中，ph?6.0(基質c)。在室溫下孵育10分鐘后，將溶解在培養基中的依次稀釋至0.015、0.05、0.15、0.5、1.5、5、15和50u/ml，而其他在優化的毒性培養基中分別稀釋至0.23、0.48、0.70、0.98、1.41、2.11、4.20、6.32和12.6u/ml。使用這些樣品按照標準協議b進行三組不同的cbpa。確定ec50值。如圖31所示，兩個批次的ec50值在基質a下為10.6±0.12和10.3±0.52u/ml，在基質b下為4.6±0.04和4.6±0.08u/ml，對于基質c為4.5±0.11和4.4±0.22u/ml。該結果表明，cbpa具有足夠的靈敏度和準確性，足以測量的生物效價，并且其靈敏度(每孔0.4-0.5u)等同于或優于小鼠的生物測定。

358、盡管已經參考特定特征詳細描述了本公開，但是對于本領域技術人員而言顯而易見的是，該描述僅是其優選實施例，并且不限制本發明的范圍。因此，本發明的實質范圍將由所附權利要求及其等同物來限定。

359、【登錄號】

360、保藏機構：韓國生命工學研究院；

361、登錄號：kctc13712bp；

362、保藏日期：2018年11月13日。

363、

364、【工業實用性】

365、本發明旨在克服常規cpba的局限性，并開發更有效的cbpa。當前，在肉毒毒素效力的測量領域中，需要開發基于細胞的效力測定法(cbpa)來代替小鼠ld50生物測定法(mld50)。根據本發明確定肉毒毒素活性的細胞和抗體是用于替代mld50的cpba的細胞和抗體。使用本發明的細胞和抗體的cbpa具有高可靠性和再現性，因此有望在制藥和化妝品領域得到積極應用。

366、【序列表】

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技術實現思路