一種檢測人腺病毒3型的熒光RPA引物和探針及其應用和檢測方法與流程

            文檔序號:39655996發布日期:2024-10-15 12:58閱讀:79來源:國知局
            一種檢測人腺病毒3型的熒光RPA引物和探針及其應用和檢測方法與流程

            本申請涉及人腺病毒檢測,具體涉及一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針及其應用和檢測方法。


            背景技術:

            1、人腺病毒(human?adenovirus,hadv)屬于哺乳動物腺病毒屬,為無包膜的雙鏈dna病毒,其中,腺病毒3型是引起呼吸道感染的主要病原體型別之一。由于人腺病毒型別眾多,無論是在臨床還是研發方面,首要的步驟就是對樣本所屬的人腺病毒型別進行判斷,但目前的對于人腺病毒型別的確定,主要是依靠測序來確定,測序技術耗時長,且對人員的專業要求較高,不適用于病原體的快速診斷。


            技術實現思路

            1、本發明的目的在于,提供一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針及其應用和檢測方法,可在20分鐘內完成對人腺病毒3型的型別檢測,大大節約病原確定的時間。

            2、本發明采取的第一種技術方案是:一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,所述引物包括正向引物rpaf2和反向引物rpar2,所述探針記為rpap,所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap的核苷酸序列如下:

            3、rpaf2:5'-attccggcacagcttacaattcactcgctcc-3';

            4、rpar2:5'-tcagtagtggtaatgtctttcccaatttgc-3';

            5、rpap:5'-acaatgcagtaactaccaccacaaacacaggcattgcttccatga-3'。

            6、進一步地,所述探針rpap采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾,熒光報告基團修飾在探針序列離5′端堿基數30bp的位置上;熒光淬滅基團修飾在探針序列離3′端堿基數17bp的位置上,熒光報告基團與淬滅基團之間間隔1個堿基a,其中所述堿基a用四氫呋喃殘基替換;修飾后探針rpap的核苷酸序列為:

            7、rpap:5'-acaatgcagtaactaccaccacaaacaca/i6famdt//idsp//ibhqdt/ggcattgcttccatga-3'。

            8、進一步地,所述熒光報告基團為fam,所述熒光淬滅基團為bhq。

            9、進一步地,所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap是基于人腺病毒3型hexon基因上loop1區域設計的。

            10、進一步地,所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap在穩定的擴增體系中,僅對人腺病毒3型進行特異性的擴增,不能擴增人腺病毒1型、2型、5型、7型、55型。

            11、進一步地,所述穩定的擴增體系包括dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01。

            12、本發明采取的第二種技術方案是:如第一種技術方案所述的檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針的應用,具體來說為將所述引物和探針制成試劑盒進行人腺病毒3型的熒光rpa檢測。

            13、本發明采取的第三種技術方案是:一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa檢測方法,使用如第一種技術方案所述的引物和探針進行熒光rpa檢測,包括如下步驟:

            14、s1:將緩沖液25μl、模板4μl、正向引物、反向引物、探針混合制作成預混液;其中,所述正向引物和反向引物的終濃度為50nm/μl~150nm/μl,探針的終濃度為80nm/μl~200nm/μl;

            15、s2:將所述預混液轉移到dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01的反應管中,使反應管中的藥劑充分溶解,在1000rpm、室溫條件下離心10s;

            16、s3:在反應管的蓋子上加入3μl?dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01的啟動劑,蓋緊管蓋,在1000rpm、室溫條件下離心10s,使啟動劑進入預混液;

            17、s4:將反應管置于熒光pcr儀中,在39℃下反應4分鐘后取出,將反應管內的溶液混合均勻,在1000rpm、室溫條件下離心10s;

            18、s5:再次將反應管放入熒光pcr儀中,在39℃下反應至30min,并且每30s收集一次熒光信號。

            19、本發明的有益效果在于:本發明在39℃下,引物濃度為100nm/μl,探針濃度為160nm/μl時,擴增效率最高,檢測靈敏度可以達到25copy/μl,20分鐘以內可以完成檢測,大大縮短了腺病毒檢測的時間;本發明的引物特異性強,能夠對人腺病毒3型進行有效的擴增,而對其他引起呼吸道感染腺病毒型別不能擴增;該檢測方法應用于對人腺病毒3型的型別檢測,操作方法簡單,檢測結果準確、快速、靈敏。



            技術特征:

            1.一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,其特征在于,所述引物包括正向引物rpaf2和反向引物rpar2,所述探針記為rpap,所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap的核苷酸序列如下:

            2.根據權利要求1所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,其特征在于,所述探針rpap采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾,熒光報告基團修飾在探針序列離5′端堿基數30bp的位置上;熒光淬滅基團修飾在探針序列離3′端堿基數17bp的位置上,熒光報告基團與淬滅基團之間間隔1個堿基a,其中所述堿基a用四氫呋喃殘基替換;修飾后探針rpap的核苷酸序列為:

            3.根據權利要求2所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,其特征在于,所述熒光報告基團為fam,所述熒光淬滅基團為bhq。

            4.根據權利要求1所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,其特征在于,所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap是基于人腺病毒3型hexon基因上loop1區域設計的。

            5.根據權利要求4所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,其特征在于,所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap在穩定的擴增體系中,僅對人腺病毒3型進行特異性的擴增,不能擴增人腺病毒1型、2型、5型、7型、55型。

            6.根據權利要求5所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針,其特征在于,所述穩定的擴增體系包括dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01。

            7.如權利要求1~6任一權利要求所述的檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針的應用,其特征在于,將所述引物和探針制成試劑盒進行人腺病毒3型的熒光rpa檢測。

            8.一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa檢測方法,使用如權利要求1~6任一權利要求所述的引物和探針進行熒光rpa檢測,其特征在于,包括如下步驟:


            技術總結
            本申請涉及一種檢測人腺病毒3型的熒光RPA引物和探針及其應用和檢測方法,所述引物和探針是基于人腺病毒3型Hexon基因上Loop1區域設計的,在穩定的擴增體系中,僅對人腺病毒3型進行特異性的擴增,而不對其他型別的人腺病毒進行增擴,具有良好的特異性。本發明在反應體系為39℃、引物濃度為100nM和探針濃度為160nM的條件下,擴增效率最高,檢測靈敏度可以達到25copy/μL,可在20分鐘內完成對人腺病毒3型的型別檢測,大大節約病原確定的時間。

            技術研發人員:張艷妮,肖芳,劉師文,吳楊博文,劉曉慶,熊英,李健雄
            受保護的技術使用者:江西省疾病預防控制中心(江西省結核病預防控制所、江西省食品安全風險評估中心)
            技術研發日:
            技術公布日:2024/10/14
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