一種檢測人腺病毒3型的熒光RPA引物和探針及其應用和檢測方法與流程

本申請涉及人腺病毒檢測，具體涉及一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針及其應用和檢測方法。

背景技術：

1、人腺病毒(human?adenovirus，hadv)屬于哺乳動物腺病毒屬，為無包膜的雙鏈dna病毒，其中，腺病毒3型是引起呼吸道感染的主要病原體型別之一。由于人腺病毒型別眾多，無論是在臨床還是研發方面，首要的步驟就是對樣本所屬的人腺病毒型別進行判斷，但目前的對于人腺病毒型別的確定，主要是依靠測序來確定，測序技術耗時長，且對人員的專業要求較高，不適用于病原體的快速診斷。

技術實現思路

1、本發明的目的在于，提供一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針及其應用和檢測方法，可在20分鐘內完成對人腺病毒3型的型別檢測，大大節約病原確定的時間。

2、本發明采取的第一種技術方案是：一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，所述引物包括正向引物rpaf2和反向引物rpar2，所述探針記為rpap，所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap的核苷酸序列如下：

3、rpaf2：5'-attccggcacagcttacaattcactcgctcc-3'；

4、rpar2：5'-tcagtagtggtaatgtctttcccaatttgc-3'；

5、rpap：5'-acaatgcagtaactaccaccacaaacacaggcattgcttccatga-3'。

6、進一步地，所述探針rpap采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾，熒光報告基團修飾在探針序列離5′端堿基數30bp的位置上；熒光淬滅基團修飾在探針序列離3′端堿基數17bp的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔1個堿基a，其中所述堿基a用四氫呋喃殘基替換；修飾后探針rpap的核苷酸序列為：

7、rpap：5'-acaatgcagtaactaccaccacaaacaca/i6famdt//idsp//ibhqdt/ggcattgcttccatga-3'。

8、進一步地，所述熒光報告基團為fam，所述熒光淬滅基團為bhq。

9、進一步地，所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap是基于人腺病毒3型hexon基因上loop1區域設計的。

10、進一步地，所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap在穩定的擴增體系中，僅對人腺病毒3型進行特異性的擴增，不能擴增人腺病毒1型、2型、5型、7型、55型。

11、進一步地，所述穩定的擴增體系包括dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01。

12、本發明采取的第二種技術方案是：如第一種技術方案所述的檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針的應用，具體來說為將所述引物和探針制成試劑盒進行人腺病毒3型的熒光rpa檢測。

13、本發明采取的第三種技術方案是：一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa檢測方法，使用如第一種技術方案所述的引物和探針進行熒光rpa檢測，包括如下步驟：

14、s1：將緩沖液25μl、模板4μl、正向引物、反向引物、探針混合制作成預混液；其中，所述正向引物和反向引物的終濃度為50nm/μl～150nm/μl，探針的終濃度為80nm/μl～200nm/μl；

15、s2：將所述預混液轉移到dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01的反應管中，使反應管中的藥劑充分溶解，在1000rpm、室溫條件下離心10s；

16、s3：在反應管的蓋子上加入3μl?dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01的啟動劑，蓋緊管蓋，在1000rpm、室溫條件下離心10s，使啟動劑進入預混液；

17、s4：將反應管置于熒光pcr儀中，在39℃下反應4分鐘后取出，將反應管內的溶液混合均勻，在1000rpm、室溫條件下離心10s；

18、s5：再次將反應管放入熒光pcr儀中，在39℃下反應至30min，并且每30s收集一次熒光信號。

19、本發明的有益效果在于：本發明在39℃下，引物濃度為100nm/μl，探針濃度為160nm/μl時，擴增效率最高，檢測靈敏度可以達到25copy/μl，20分鐘以內可以完成檢測，大大縮短了腺病毒檢測的時間；本發明的引物特異性強，能夠對人腺病毒3型進行有效的擴增，而對其他引起呼吸道感染腺病毒型別不能擴增；該檢測方法應用于對人腺病毒3型的型別檢測，操作方法簡單，檢測結果準確、快速、靈敏。

技術特征：

1.一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，其特征在于，所述引物包括正向引物rpaf2和反向引物rpar2，所述探針記為rpap，所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap的核苷酸序列如下：

2.根據權利要求1所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，其特征在于，所述探針rpap采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾，熒光報告基團修飾在探針序列離5′端堿基數30bp的位置上；熒光淬滅基團修飾在探針序列離3′端堿基數17bp的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔1個堿基a，其中所述堿基a用四氫呋喃殘基替換；修飾后探針rpap的核苷酸序列為：

3.根據權利要求2所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，其特征在于，所述熒光報告基團為fam，所述熒光淬滅基團為bhq。

4.根據權利要求1所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，其特征在于，所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap是基于人腺病毒3型hexon基因上loop1區域設計的。

5.根據權利要求4所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，其特征在于，所述正向引物rpaf2和反向引物rpar2和探針rpap在穩定的擴增體系中，僅對人腺病毒3型進行特異性的擴增，不能擴增人腺病毒1型、2型、5型、7型、55型。

6.根據權利要求5所述的一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針，其特征在于，所述穩定的擴增體系包括dna恒溫核酸擴增試劑盒dna-sl01。

7.如權利要求1～6任一權利要求所述的檢測人腺病毒3型的熒光rpa引物和探針的應用，其特征在于，將所述引物和探針制成試劑盒進行人腺病毒3型的熒光rpa檢測。

8.一種檢測人腺病毒3型的熒光rpa檢測方法，使用如權利要求1～6任一權利要求所述的引物和探針進行熒光rpa檢測，其特征在于，包括如下步驟：

技術總結
本申請涉及一種檢測人腺病毒3型的熒光RPA引物和探針及其應用和檢測方法，所述引物和探針是基于人腺病毒3型Hexon基因上Loop1區域設計的，在穩定的擴增體系中，僅對人腺病毒3型進行特異性的擴增，而不對其他型別的人腺病毒進行增擴，具有良好的特異性。本發明在反應體系為39℃、引物濃度為100nM和探針濃度為160nM的條件下，擴增效率最高，檢測靈敏度可以達到25copy/μL，可在20分鐘內完成對人腺病毒3型的型別檢測，大大節約病原確定的時間。

技術研發人員：張艷妮,肖芳,劉師文,吳楊博文,劉曉慶,熊英,李健雄
受保護的技術使用者：江西省疾病預防控制中心（江西省結核病預防控制所、江西省食品安全風險評估中心）
技術研發日：
技術公布日：2024/10/14