一種質粒保存液、保存質粒的方法和應用與流程

本發明屬于質粒保存，具體涉及一種質粒保存液、保存質粒的方法和應用。

背景技術：

1、隨著分子診斷技術的日趨成熟，我國分子診斷產品的種類也越來越多，如腫瘤標志物檢測、病原微生物檢測、藥物基因檢測和遺傳缺陷檢測等試劑盒。在該類分子診斷產品中往往需要設計質控品，其被用來監測整個檢測反應過程是否正常，檢測結果是否可靠、可信。目前，重組質粒由于眾多優點而被越來越多地用于陽性質控品生產，如：相對于活病原菌，重組質粒具有生物安全性強、易于大量制備等優點；相對于人源基因組dna，重組質粒具有不存在人員異質性，易于大量制備，另外，也不存在商業化的合規風險等優點。重組質粒作為pcr試劑盒的陽性質控品，一般需要設計較低的濃度，稱之為弱陽性。但質粒濃度過低，其保存的有效期也越難保證，對質粒作為質控品生產提出挑戰。

2、重組質粒為一種環狀雙鏈脫氧核糖核酸分子，長度不超過200kb，其結構類型主要有共價閉合環形(通常呈現超螺旋構型)、開環(其中一條鏈斷裂)和線性(兩條鏈均斷裂)三種構型。生產過程一般為：人工選擇一段靶基因序列，提供給供應商進行實驗室內序列合成；再連接入質粒載體序列(重組)，如常用的puc57載體，然后轉化入細菌體內，通過細菌的大量繁殖，產生大量質粒；最后，通過細菌裂解，釋放出重組質粒，進一步提取純化和洗脫可獲得所需要的重組質粒。重組質粒洗脫常用的溶液為無核酸酶水、te緩沖液，需要高濃度儲存于-20℃環境，避免反復凍融。而作為質控品生產的質粒，不僅需要濃度低，還需要考慮試劑的臨床使用，面臨運輸、高溫、凍融等條件，對質粒的低濃度使用提出挑戰。

3、低濃度質粒保存和使用過程中面臨的困難主要由以下因素引起：1、裝質粒的管材為塑料，而塑料管塞件表面有靜電，該靜電是由原子外層的電子受到各種外力的影響發生轉移，分別形成正負離子造成的。這種靜電離子是在塑料管塞加工過程中由于不可避免的凹凸模具脫模剝離，塑料管塞成品轉運過程中的空氣摩擦等因素產生。另外，塑料管塞表面還常常存在微小的凹凸不平，這些微小的凹凸結構會在表面形成物理作用。因而，與塑料管材接近的核酸分子容易非特異吸附其表面，當質粒濃度越低，這種表現就會越明顯；2、脫氧核糖核酸分子自發水解，尤其在稀酸下易發生脫嘌呤反應；3、脫氧核糖核酸分子容易受到核酸酶催化降解；4、凍融、劇烈震蕩等過程產生外力，加快脫氧核糖核酸分子降解。基于以上四個因素，研究人員已經給出一些解決方法，如專利cn?103173433a為解決人體基因組dna完整保存，發明了一種dna低溫保存溶劑，專利cn?110511926a為避免質粒、假病毒凍融，發明了一種2-8℃保存溶液，但這兩個專利均未對低濃度的質粒保存進行研究。專利cn115960888?a雖然針對低濃度合成dna片段在不同溫度下的穩定性開發了一款dna保存液，但并沒有對質粒凍融和質粒結構方面進行研究。由于生產常用的質粒為超螺旋結構，pcr過程中很難解鏈，導致pcr檢測不理想(表現ct偏大)。因此，為滿足低濃度質粒的保存和使用，需要提供一款能滿足低濃度質粒在-20℃保存穩定，且能夠經受起凍融和有助于質粒螺旋結構打開的保存液成為該技術領域急需解決的技術難題。

技術實現思路

1、為了解決現有技術中的問題，本發明提供一種質粒保存液、保存質粒的方法和應用，達到能滿足低濃度質粒在-20℃±5℃下穩定保存，低至1.0×105拷貝/ml；保存的低濃度質粒能夠經受起高溫和凍融，另外，該質粒保存液有助于質粒超螺旋結構打開，不影響qpcr檢測的目的。

2、本發明解決其技術問題是采用以下技術方案實現的：

3、本發明目的在于提供一種質粒保存液，包括以下組分：

4、te緩沖液1×-5×

5、l-脯氨酸0.05m-0.5m

6、tween?20?0.05％-0.5％

7、trna溶液20μg/ml-30μg/ml。

8、進一步的，包括以下組分：

9、te緩沖液1×te

10、l-脯氨酸?????0.1m

11、tween?20?????0.1％

12、trna溶液30μg/ml。

13、進一步的，保存液的制備方法包括以下步驟：

14、s1：將te緩沖液稀釋為工作液，作為其它組分的稀釋基質；將tween?20稀釋備用；

15、s2：稱取l-脯氨酸，再加入te溶液進行溶解，然后定容配制成母液，備用；

16、s3；量取s2制備的母液，再加入s1制備的tween?20稀釋溶液和trna溶液，再補充te溶液至配方量，配制成質粒保存液。

17、進一步的，保存液制備方法：

18、s1：將20×te緩沖液稀釋為1×te工作液，作為其它組分的稀釋基質；由于tween20原液較濃稠，為減少后續加樣誤差，需將tween?20稀釋為10％溶液備用；

19、s2：稱取57.565g?l-脯氨酸加入燒杯，再加入1×te溶液進行溶解，轉移至容量瓶進行定容至100ml，配制成5m的母液，備用；

20、s3；量取一定體積濃度為5m的l-脯氨酸溶液，再加入一定體積濃度為10％的tween20溶液和一定體積trna溶液，再用1×te溶液補充至指定體積，配制成相應的質粒保存液。

21、本發明目的還在于提供一種保存質粒的方法，方法包括：稀釋質粒母液，然后置于所述質粒保存液中保存。

22、進一步的，稀釋后質粒的濃度為至少1.0×105拷貝/ml。

23、進一步的，質粒保存在-25℃-37℃條件下，保存至少4周。

24、進一步的，凍融次數至少12次。

25、本發明目的還在于提供一種質粒保存液或一種保存質粒的方法在制備試劑盒中的應用。

26、本發明的質粒保存液以te緩沖液為基礎，添加l-脯氨酸、tween20和trna溶液組成，其中各組分的作用如下：

27、te緩沖液：1×te緩沖液由三羥甲基氨基甲烷(tris)和乙二胺四乙酸(edta)混合而成，ph為7.5，其終濃度為10mm?tris-hcl和1mm?edta。te緩沖液是弱堿性，對dna的堿基有保護性(dna在te中穩定性較好，不易被破壞其完整性或產生開環及斷裂))。另外，edta是一種螯合劑，可以螯合金屬離子，避免核酸酶對質粒降解。

28、l-脯氨酸：用于pcr中，可以改善質粒的變性情況，降低質粒解鏈的tm值。

29、tween?20：一種來源于山梨聚糖類酯的吐溫類非離子型表面活性劑，適量濃度可以用來裂解細胞，另外，也可降低表面吸附。

30、trna：減少了目標核酸物質的管壁吸附損失，進而提高微量的核酸處于游離狀態，同時降低了環境中的核酸酶降解微量核酸的概率。

31、與現有技術相比，本發明的有益技術效果在于：

32、(1)本發明的質粒保存液能夠滿足1.0×105拷貝/ml的質粒在-20±5℃條件下長期保存，不低于12個月；37℃條件下，至少能保存4周；凍融不少于12次。

33、(2)本發明的質粒保存液能夠直接加入pcr試劑，不干擾反應。

34、(3)本發明的質粒保存液有助于超螺旋重組質粒結構打開，降低qpcr檢測ct。

35、上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，而可依照說明書的內容予以實施，并且為了讓本發明的上述內容和其目的、特征和優點能夠更明顯易懂，以下特舉本發明的具體實施方式。